Práctica No.4 Dilución bacteriana, número más probable y cultivo puro

Halos de Inhibición

Por Quistián García Hylary

Un antibiótico ha sido definido como una sustancia química producida por un microorganismo capaz de inhibir el desarrollo de otros microorganismos. El aislamiento de un agente infeccioso a partir de un paciente no es con frecuencia suficiente para establecer la terapia adecuada. Muchas bacterias y algunos hongos presentan resistencia a los agentes antimicrobianos y algunos virus han desarrollado resistencia a los agentes antivirales más actuales. Los patrones de resistencia cambian en forma constante y no importa lo rápidamente que se introduzcan los nuevos agentes terapéuticos porque los microbios parecen siempre dispuestos a superarlos.

Ya que no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias, hongos y virus a los agentes antimicrobianos, con frecuencia es necesario estudiar la sensibilidad individual de cada patógeno a estas drogas, pudiéndose elegir entonces el agente apropiado, que proporciona mayores posibilidades de una evolución favorable. Por supuesto, el resultado terapéutico final depende de muchas otras variables.

En líneas generales y en función sobre su forma de actuar sobre los microorganismos, hablamos de dos grandes grupos de antibióticos

·         Antibióticos primariamente bactericidas: Ejercen una acción letal e irreversible sobre el microbio.

·         Antibióticos primariamente bacteriostáticos: Inhiben el crecimiento pero no matan al microorganismo, permitiendo que las propias defensas del huésped pueden eliminar a las bacterias.

ANTIBIOGRAMA

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico. El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las resistencias bacterianas.

Se debe realizar un antibiograma siempre que una toma bacteriológica de finalidad diagnóstica haya permitido el aislamiento de una bacteria considerada responsable de la infección.

La determinación de la Concentración Inhibidora Mínima (CIM) es la base de la medida de la sensibilidad de una bacteria a un determinado antibiótico. La CIM se define como la menor concentración de una gama de diluciones de antibiótico que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del antibiótico frente a diferentes especies bacterianas.

Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS:

·         Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un tratamiento a la dosis habitual.

·         Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento.

·         Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto terapéutico en ciertas condiciones

Ciertos mecanismos de resistencia se expresan débilmente in vitro, cuando se inscriben en el DNA bacteriano. Su expresión en el organismo, en donde las condiciones en cuanto a medios son diferentes, expondría al riesgo de fracaso terapéutico. Para evitar esto, el antibiograma debe ser interpretado de manera global a fin de descubrir, a través de la comparación de las respuestas para cada antibiótico, un mecanismo de resistencia incluso débilmente expresado. Así, gracias a la interpretación, una cepa que aparece como falsamente sensible será categorizada como I o R.

RESISTENCIA BACTERIANA

Cada antibiótico se caracteriza por un espectro natural de actividad antibacteriana. Este espectro comprende las especies bacterianas que, en su estado natural, sufren una inhibición de su crecimiento por concentraciones de su antibiótico susceptibles de ser alcanzadas in vivo.

·         La resistencia natural es un carácter constante de todas las cepas de una misma especie bacteriana. El conocimiento de las resistencias naturales permite prever la inactividad de la molécula frente a bacterias identificadas o sospechosas.

·         La resistencia adquirida es una característica propia de ciertas cepas, dentro de una especie bacteriana naturalmente sensible, cuyo patrimonio genético ha sido modificado por mutación o adquisición de genes, son evolutivas, y su frecuencia depende a menudo de la utilización de los antibióticos.

·         Una resistencia cruzada es cuando se debe a un mismo mecanismo de resistencia. En general, afecta a varios antibióticos dentro de una misma familia En ciertos casos, puede afectar a antibióticos de familias diferentes.

·         Una resistencia asociada es cuando afecta a varios antibióticos de familias diferentes. En general, se debe a la. Asociación de varios mecanismos de resistencia

Por Ramírez Hernández Jessica

La técnica actualmente utilizada para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos es el producto de importantes esfuerzos internacionales desde hace más de dos décadas enfocados a normatizar el método.

El principio del método involucra el uso de una cantidad constante de antimicrobianos en un reservorio (discos de papel) aplicado sobre la superficie del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo en cuestión. Se formará así por difusión, un gradiente de concentración del antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del reservorio. El diámetro obtenido dependerá no solo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino también del espesor de la capa del agar, su pH y composición, de la capacidad de difusión de la droga en ese medio, la temperatura, la velocidad de duplicación bacteriana, y el tamaño y fase de crecimiento del inóculo. Para que los resultados sean confiables los procedimientos deberán ser controlados y estandarizados cuidadosamente.

Las pruebas de sensibilidad están indicadas para cualquier microorganismo, contribuyendo hacia orientar el tratamiento quimioterápico de los procesos infecciosos, si su sensibilidad no puede ser predicha a partir del conocimiento de la identidad del germen.

Frecuentemente están indicadas en caso que la especie en estudio sea capaz de mostrar resistencia a los antibióticos usados comúnmente.

Las pruebas de sensibilidad pueden ser necesarias cuando aún, conociéndose la sensibilidad del germen a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicación (por ejemplo: S. pyogenes en pacientes alérgicos a la penicilina, en este caso puede probarse su sensibilidad frente a eritromicina y otros macrólidos).

El antibiograma puede ser indicado con fines epidemiológicos de resistencia y en el estudio de nuevos antibióticos. Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a partir de una cepa aislada. Se debería evitar realizar el antibiograma en forma directa a partir del material clínico, excepto en las emergencias clínicas donde la coloración directa de GRAM sugiere naturaleza monobacteriana.

REACTIVOS PARA EL TEST DE DIFUSION POR DISCO

4.1. Agar Mueller-Hinton

De los medios disponibles se considera al agar M-Hinton el mejor para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que:

• Muestra buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad .

• Contiene bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina.

• Es adecuado para el desarrollo de la mayoría de las bacterias patógenas.

• Existen suficientes datos recopilados que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad realizadas en este medio.

Aunque el agar M. Hinton es generalmente confiable para las pruebas de sensibilidad, los resultados obtenidos con algunos lotes pueden, en ocasiones, variar significativamente. Si un lote de medio no sustenta el adecuado crecimiento de los microorganismos probados, los halos obtenidos en las pruebas por difusión podrían ser mayores quedando fuera de los límites de control de calidad , conduciendo a resultados erróneos.

 4.1.1. Preparacion del agar Mueller Hinton

(1) Prepare el agar M. Hinton a partir de la base deshidratada de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.

(2) Inmediatamente después de esterilizar haga enfriar en baño de agua hasta 45-50ºC.

(3) Ponga el medio en las placas de Petri hasta un nivel aproximado de 4 mm. Esto corresponde a 60 - 70 ml de medio para placas de 150 mm. de diámetro y 25 a 30 ml. para las de 100 mm. de diámetro interno.

(4) Las placas que no se usan en el día pueden mantenerse en refrigerador (2-8 ºC.).

(5) Las placas con más de 7 días de preparación no son adecuadas para las pruebas de sensibilidad salvo que sean envueltas en bolsas de plástico para evitar la desecación, de lo contrario deberán controlarse con los microorganismos de referencia, como se especifica en la sección 9.2.

(6) Debe controlarse la esterilidad de cada lote incubando 24 horas o mas a 30-35 ºC.

Luego descarte esas muestras.

pH. El pH para cada lote debe ser controlado cuando se prepara el medio. El agar debe tener un pH 7,2 - 7,4 a temperatura ambiente y debe determinarse después de su solidificación. Si el pH es demasiado bajo, ciertas drogas (pej. Aminoglucósidos, quinolonas y macrólidos) parecerán menos activas; mientras otras (pej. tetraciclinas) parecerán tener mayor actividad. Si el pH es demasiado alto se podrían esperar los efectos opuestos.

4.1.3. Humedad

Si justo antes de usar, hay exceso de humedad en la superficie, las placas deben ser incubadas a 35ºC durante 10 - 30 min. Las placas deberán estar húmedas pero no mostrar gotas sobre la superficie del medio.

4.1.4. Efecto de la Timina o Timidina

Los medios que contienen excesiva cantidad de timina o timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima, produciendo así zonas más pequeñas, menos nítidas o sin halo lo cual puede dar como resultado un informe de falsa resistencia.

El agregado de timidina fosforilasa o sangre lisada de caballo puede mejorar la nitidez de los halos y la confiabilidad de las pruebas para sulfonamidas y trimetoprima frente a patógenos comunes, excepto para enterococos. Para evaluar cada lote de Mueller Hinton en su contenido de Timidina se debe utilizar una cepa control (Enterococcus faecalisATCC® 29212 o ATCC® 33186) que se prueba frente a discos de trimetoprima / sulfametoxazol. Un medio satisfactorio mostrará un halo de inhibición claro y definido de 20 mm o más.

4.1.5. Efectos por variación en la composición de cationes divalentes

La variación en cationes divalentes principalmente Ca++ y Mg++ afectarán los resultados con tetraciclina, colistín y aminoglucósidos frente a Ps. aeruginosa. Un excesivo contenido de cationes reducirá la zona de inhibición, mientras que bajas concentraciones de cationes resultarán en zonas de inhibición mayores que las esperadas. Un exceso de zinc podría reducir las zonas de inhibicón de los carbapenems. Las pruebas realizadas con cada lote de agar M. Hinton deben estar de acuerdo con los límites de control de la Tabla 3. Los resultados de las pruebas con las cepas patrones deben ser cuidadosamente observados para detectar cualquier valor aberrante debido a la composición de cationes del medio de cultivo.

Almacenamiento de los discos de ATB

Los discos de ATB deberán ser almacenados de la siguiente manera :

• Mantenerlos refrigerados a 8 ºC o en freezer a -14 ºC o menos, para mantener la droga en condiciones óptimas.

• Los discos que contienen drogas de la familia de antibióticos betalactámicos deben mantenerse en freezer para mantener su potencia. Los de pequeños stocks pueden mantenerse en el refrigerador.

• Los discos deben ser sacados del refrigerador o freezer 1 ó 2 horas antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la temperatura antes de ser abiertos los frascos. Este proceso evita la condensación que podría ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los frascos fríos.

• Cuando el indicador del desecador usado cambia de color debe interpretarse como un exceso de humedad y reemplazarse.

• Use solo los discos que no han sido calificados por sus fabricantes como vencidos.

4.3. Turbidez estándar para la preparación del inóculo

Para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland).

(a) Para prepararlo proceda de la siguiente manera:

(b) Prepare dicho estándar agregando 0,5 ml de BaCl2 0,048M (1,175% P/V BaCl2.2H2O) a 99,5 ml de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V).

(c) Verifique la densidad correcta del estándar usando un espectrofotómetro. La absorbancia a 625 nm debería ser 0,08 - 0,10 para el estándar 0,5 de Mc Farland.

(d) Distribuya 4 - 6 ml dentro de tubos similares a los que va a usar para preparar inóculos.

(e) Mantenga los estándares guardados a temperatura ambiente al abrigo de la luz.

(f) Agite vigorosamente el estándar antes de su uso para lograr una turbidez homogénea.

(g) Reemplace o verifique la confiabilidad de los estándares mensualmente.

Método directo de inoculación a partir de colonia aislada

<1> Como un método alternativo al descripto anteriormente el inóculo puede ser realizado en solución salina o caldo a partir de colonias seleccionadas de una placa de cultivo no selectivo de 18 a 24 horas de incubación. Inmediatamente la suspensión debe ser ajustada a la escala 0,5 de Mc Farland según los lineamientos de la sección 5.1.1.

 <2> Este método es de elección para microorganismos fastidiosos, ej: Haemophilus spp., Streptococcus spp. y Neisseria gonorrhoeae, (ver sección 6.0.) o para Staphylococcus potencialmente meticilino resistentes.

5.2. Inoculación de las placas

<1> Dentro de los 15 minutos después de ajustado el inóculo siembre las placas de M. Hinton con un hisopo estéril. Presione el hisopo contra las paredes del tubo a fin de escurrir el exceso de inóculo.

<2> Inocule la superficie seca del M. Hinton por hisopado en tres direcciones para asegurar una completa distribución del inóculo. Las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y el desarrollo confluente o casi confluente.

<3> Si crecen solo colonias aisladas el antibiograma debe repetirse. Espere de 3 a 5 minutos, pero no más de 15 min. antes de aplicar los discos para que el exceso de humedad superficial sea absorbido.

<4> NOTA: Nunca use cultivos over-nigth ni otros inóculos no estandarizados para el hisopado de las placas. Evitar extremos en la densidad del inóculo.

5.3. Aplicación de los discos de ATB en las placas inoculadas

<a> Colocar los discos sobre la superficie del agar inoculada con pinza estéril aplicando una ligera presión a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro. Debido a que algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no debe ser removido una vez que tomó contacto con la superficie del agar. No deben colocarse mas de 12 discos por placa de 150 mm y no más de 5 discos por placa de 100 mm.

<b> Incubar las placas invertidas a 35 ºC dentro de los 15 minutos posteriores a que los discos fueron aplicados. Con excepción de Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus spp. (ver sección 6), las placas no deberán ser incubadas en concentración incrementada de CO2 porque los estándares de interpretación fueron desarrollados usando incubación ambiente y el agregado de CO2 alteraría significativamente el tamaño de las zonas inhibitorias para algunos agentes antibióticos.

5.4. Lectura de las placas e interpretación de resultados

<a> Después de 16 a 18 horas de incubación examine cada placa y mida los diámetros de las zonas de inhibición. Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y el inóculo fue el correcto, las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y habrá desarrollo confluente.

Si el microorganismo estudiado es un Staphylococcus spp. o Enterococcus spp., incube 24 horas para vancomicina y oxacilina, pero los otros antimicrobianos pueden leerse entre las 16-18 hrs. Use luz transmitida para examinar un ligero crecimiento de cepas meticilino o vancomicina resistentes dentro de las zonas de inhibición. Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibición es indicativo de meticilino o vancomicina resistencia.

Por Ramos Franco Michelle

Es la zona alrededor de un disco de antibiótico en un antibiograma en el que no se produce crecimiento bacteriano en una placa de agar inoculado con el germen.

Es una medida de la potencia de antibiótico frente al germen

Una vez completado este proceso, la placa se coloca en estufa de cultivo y comienza, por un lado, el crecimiento de la bacteria y comienza, por el otro, la difusión del antibiótico desde el disco de papel

El antibiótico se aleja del disco según un gradiente de dilución, de modo que, a mayor distancia, menor concentración.

Esto da lugar a que, determinada distancia del disco de papel la dilución del antibiótico no alcance a inhibidora el crecimiento de la bacteria y que se formo un lado de inhibición circular

Cuyo diámetro será directamente proporcional del antibacteriano frente a la bacteria en cuestión e inversamente proporcional a la concentración inhibitoria mínima (CIM) del agente antimicrobiano

La medición del halo de inhibición

Por la parte trasera de la placa incubada mediremos el diámetro de los halos de inhibición que se han formado alrededor de los discos de antibiótico a los que la bacteria “problema es sensible”

Por Luis Diego Reyes Marcial

Antibiograma.

El antibiograma, son métodos in vitro que determinan la susceptibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes microbianos, bajo condiciones de laboratorio especificas y estandarizadas.

Método Kirby-Bauer

Es una prueba de inhibición que se emplea para determinar la sensibilidad de un agente microbiano frente a un antibiótico o quimioterápico. Se aplica sobre una placa de agar Muller-Hinton, se inocula y se colocan discos de papel filtro impregnados con antibióticos.

Inhibición

El tamaño del halo de inhibición de desarrollo variará en base a los siguientes parámetros o variables:

• Concentración de la droga
•  Sensibilidad bacteriana
• Coeficiente de difusión de la droga
• Tiempo y temperatura de incubación
• pH y composición del medio
• Profundidad del medio
• Tamaño del inóculo

Categorías de interpretación

Sensible: el microorganismo presenta una gran área de inhibición causada por el fármaco.

Intermedio: se presenta un halo de inhibición más reducido.

Resistente: presenta muy poco o casi nada de halo.

Medición de los halos

Después de incubar las placas del antibiograma se procede a su lectura. Se usa una regla y se mide el radio del halo de inhibición partiendo desde donde está el disco de antibiótico hasta donde se inhibió el crecimiento. La longitud obtenida después se compararán con estándares que nos dirán si el medicamento será efectivo o no en el tratamiento.

Número más probable (NMP)

Por Quistián García Hylary

Es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible.

La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelos u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística. El atributo particular a usarse en esta técnica es la capacidad de microorganismos a formar colonias en medios sólidos de crecimiento.

La metodología es la siguiente:

1)      Muestras: colecte asépticamente las muestras frescas de suelo (10 gr) de varios lugares, u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcos.

2)      Extracción de microorganismos viables: para muestras de suelo, las células podrán ser removidas y homogenizadas añadiendo 1 gr de la muestra a un tubo de ensayo que contenga 9 ml de solución salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex.

3)      Diluciones en serie: el extracto de suelo puede ser diluido serialmente transfiriendo 1ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Repetir en serie el procedimiento hasta alcanzar una dilución 10^-7. Para  muestras líquidas, mezcle bien la muestra y proceda a preparar las diluciones seriadas según el procedimiento anterior.

4)      Placas Petri: utilizando un marcador, dividir la caja Petri en cinco zonas de igual tamaño. Use una caja por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser inoculado.

5)      Inoculación: transfiera 5µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita esta operación cinco veces por cada dilución.

6)      Permita que el inoculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa con una trilladle de parafina, invierta la placa e inocule a 25ºC por 7 días.

7)      Evaluación del crecimiento: para cada dilución es ascendencia evalué el crecimiento o No crecimiento sobre cada replica inoculada. Reporte los resultados como se indica a continuación:

DATOS Y ANALISIS

Con ayuda de la siguiente tabla, determine la población estimada para su muestra. Si el patrón de respuestas no se encuentra en la tabla, se promedia el valor estimado del patrón superior e inferior en la tabla. Estos valores son el NMP sin ajustar. Para calcular la densidad poblacional de la muestra, entonces tendrá que multiplicar el NMP sin ajustar por el factor de corrección de volumen, por el reciproco del factor de dilución menor inoculado en la placa. 

Por Ramírez Hernández Jessica

EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística. Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de plantas, (ii) provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (iii) determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.

METODOLOGIA

1. Muestras: Colecte asépticamente muestras frescas de suelo (10 g) de varios lugares u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcas.

2. Extracción de microorganismos viables: Para muestras de suelo, las células podrán ser removidas y homogenizadas añadiendo 1 g de muestra a un tubo de ensayo que contenga 9 ml de solución salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex.

3. Diluciones en serie: El extracto de suelo puede ser diluido seriadamente transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferencia corresponde a una dilución de 1 en 10. Repita en serie el procedimiento de dilución hasta alcanzar la dilución 10-7. Para muestras líquidas, mezcle bien la muestra y proceda a preparar las diluciones seriadas como fueron descritas anteriormente.

4. Placas Petri: Utilizando un marcador, divida la placa Petri en cinco zonas de igual tamaño. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser inculcado.

5. Inoculación: Transfiera 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita esta operación cinco veces por cada dilución:

6. Permita que el inóculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa con un tirillade parafina. Invierta la placa e incube a 25°C por 7 días.

7. Evaluación de crecimiento: Para cada dilución en ascendencia evalúe el crecimiento o no crecimiento sobre cada réplica inoculada.

Datos y Análisis:

Utilizando los valores ofrecidos en la tabla 1, determine la población estimada para su muestra (ej., 5-5-3-2-0: 1,383). De su patrón de respuestas no estar en la tabla, promedie el valor estimado del patrón superior e inferior presente en la tabla 1 (ej., 5-4-1-1-0 no está en la tabla, entonces promedie 5-4-1-0-0 (169) y 5-4-2-0-0 (216) como el resultado más apropiado: 5-4-1-1-0 = (169+216)/2 = 193). Este valor obtenido es el NMP sin ajustar.

Para calcular la densidad poblacional de la muestra, entonces tendrá que multiplicar el NMP sin ajustar por el factor de corrección de volumen por el recíproco del factor de dilución menor inoculado en la placa (ej., 5-5-3-2-0: 1,383 X 200 X 1000 = 2.78 x 108 células/g de suelo).

Por Ramos Franco Michelle

En este método el número más probable es también conocido como el método de los ceros de pisson es una forma de obtener datos cuantitativos en concentración de elementos diversos a partir de datos de incidencia +/- .

Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se emplean cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es favorable. El método de basar en determinar la presencia o ausencia  (+ o -)  de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de las muestras de suelos u otros ambientes

Algunas de las ventajas de NMP son:

• La capacidad de estimar tamaños poblacionales basadas en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo, se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden hodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de plantas
• Provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados
• Determino solo organismos vivos y activos metabólicamente
• Suelen ser más rápido igual de confiable de los métodos tradicionales de espaciamiento en plantas de cultivo entre otras
• Se utiliza para contar microorganismos que son diferentes de cultivar en medio solido

Por Rangel Osorio Hugo

EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística.

1.  Muestras: Colecte asépticamente muestras frescas de suelo (10 g) de varios lugares u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcas.
2.  Extracción de microorganismos viables: Para muestras de suelo, las células podrán ser removidas y homogenizadas añadiendo 1 g de muestra a un tubo de ensayo que contenga 9 ml de solución salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex.
3. Diluciones en serie: El extracto de suelo puede ser diluido seriadamente transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferencia corresponde a una dilución de 1 en 10. Repita en serie el procedimiento de dilución hasta alcanzar la dilución 10-7. Para muestras líquidas, mezcle bien la muestra y proceda a preparar las diluciones seriadas como fueron descritas anteriormente.
4. Placas Petri: Utilizando un marcador, divida la placa Petri en cinco zonas de igual tamaño. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser inoculado
5. Inoculación: Transfiera 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita esta operación cinco veces por cada dilución
6. Permita que el inóculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa con un Tirilla de parafina. Invierta la placa e incube a 25°C por 7 días.
7. Evaluación de crecimiento: Para cada dilución en ascendencia evalué el crecimiento o no crecimiento sobre cada réplica inoculada.

Por Rascón Castrejón Lizeth

El método del Número más probable (NMP) también conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es factible. El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes.

Algunas de las ventajas del NMP son:

·         La capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinarla densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de plantas.

·         Provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados.

·         Determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente.

·         Suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.

Se utiliza para contar microorganismos que son difíciles de cultivar en medio sólido. También se usa para determinar el número de células de un cultivo mixto que pueden crecer en un medio líquido determinado. Por ejemplo, puede emplearse para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias probablemente sean Escherichia Coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y la presencia de E. Coli en el agua potable es una prueba presuntiva de contaminación

Por Ríos Palacios Selene

El método del Número más probable (NMP) (Most probable number - MPN - en inglés), también conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es factible.

El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes.

Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contendrán tan sólo un microorganismo y otros tubos no contendrán ninguno. Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna célula, se puede estimar el número más probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadística

Aplicación

Este método se usa para contar microorganismos difíciles de cultivar en medio sólido,o para determinar el número de células que pueden crecer en un medio líquido determinado, como el análisis para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de bacterias Escherichia coli que pueden crecer en un medio con lactosa. La presencia de E. coli en el agua potable es una prueba de contaminación.

En microbiología, el método se emplea habitualmente realizando diluciones en serie de un cultivo de bacterias en un medio de crecimiento, y luego divisiones adicionales en serie hasta obtener partes alícuotas. Los cultivos son incubados y evaluados a ojo, eludiendo el tedioso recuento de colonias, o el caro y tedioso recuento microscópico.

Crecimiento bacteriano en tubo

Por Quistián García Hylary

·    

Bacterias aerobias estrictas: forman parte de un tipo de organismo que necesita de un ambiente que contenga oxígeno diatómico (un gas compuesto por dos átomos de oxígeno) para poder existir y desarrollarse adecuadamente, es decir, éstas bacterias necesitan oxígeno para la respiración celular. Utilizan el oxígeno para oxidar sustratos (tales como grasas y azúcares) para obtener energía. (1)

·     Bacterias anaerobias estrictas: Son aquellas que para crecer en la superficie de un medio de cultivo necesitan una atmósfera sin oxígeno, ya que este elemento es tóxico para ellas. Carecen del sistema del citocromo oxidasa, superoxido dismutasa y catalasa para metabolizar el O2. Requieren unpotencial redox bajo. Están diseminadas ampliamente en la naturaleza. Viven en la flora normal de mucosas, piel, boca, vías aéreas superiores y tracto genitourinario femenino e intestino. (2)

·   Facultativas: son bacterias que se adaptan para crecer y metabolizar tanto en presencia como en ausencia de oxígeno. (3)

·   Microaerófilo: requieren oxígeno en niveles inferiores a los presentes en la atmosfera. Emplean oxígeno pero en cantidades muy bajas. (4)

·       Aerotolerante: Pueden sobrevivir en presencia de oxígeno pero no lo emplean ya que son anaeróbicos. Toleran concentraciones bajas de oxigeno: 2 a 8 % (5)

      Morfología de colonia en tubo:

Por Ramírez Hernández Jessica

Las bacterias facultativas son bacterias que pueden adaptarse para crecer y metabolizar tanto en presencia como en ausencia de oxígeno, por lo que también se les llama anaerobias facultativas o aerobias facultativas. Pueden desarrollar un metabolismo tanto respiratorio usando el oxígeno como fermentativo en ausencia de oxígeno. Las bacterias anaerobias facultativas pueden obtener energía en ausencia de oxígeno, pero el oxígeno no les es tóxico.

Las proteobacterias (Proteobacteria) son uno de los principales grupos de bacterias. Incluyen una gran variedad de patógenos, las más imporrtantes son:

•          Escherichia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter, Neisseria gonorrhoeae y muchos otros.

Otro grupo de bacterias facultativas son de vida libre, e incluyen muchas de las bacterias responsables de la fijación del nitrógeno. El grupo se establece principalmente en términos de secuencias de ARN, y se denominan así en honor aldios griego Proteus, el cual podía cambiar de forma, dada la gran diversidad de formas encontradas en ellas.

Todas las proteobacterias son Gram negativas, con una pared celular formada principalmente de lipopolisacáridos, su morfología es muy variable, desde bacilos, hastas cocos simples hasta géneros con prosteca, y más e incluso cuerpos fructíferos.

Muchas de estas bacterias se mueven utilizando flagelos, pero algunas lo pueden hacer por deslizamiento bacterial. Entre estas se encuentran las mixobacterias, un grupo único de bacterias que pueden agruparse para formar cuerpos fructíferos.

Tienen también una gran variedad de tipos de metabolismo. La mayoría de las proteobacterias son anaeróbias, pero hay muchas excepciones. Las mitocondrias que permiten respirar a las células eucariotas se derivan de proteobacterias, probablemente similares a las rickettsias.

La nutrición es usualmente heterótrofa, pero hay dos grupos que realizan la fotosíntesis, denominadas bacterias púrpuras. Las bacterias púrpuras del azufre usan azufre o sulfuro de hidrógeno como donante de electrones, mientras que las bacterias púrpuras no del azufre utilizan hidrógeno. Puesto que esta función no es realizada por el agua, como es común en plantas y cyanobacterias, no se produce oxígeno.1

Existe un subgrupo de bacterias, denominadas de aerotolrantes como las del ácido láctico, estas, aunque pueden crecer en presencia de oxígeno, no pueden utilizarlo, sino que obtienen energía exclusivamente por fermentación.

Se puede identificar el tipo de respiración de los microorganismos, mediante el tipo de crecimiento en un medio líquido de cultivo:

1.      Aerobio estricto
2. Anaerobio estricto
3. Facultativo
4. Microaerófilo
5. Aerotolerante (anaerobio)

Por Rangel Osorio Hugo

Las bacterias facultativas son bacterias que pueden adaptarse para crecer y metabolizar tanto en presencia como en ausencia de oxígeno, por lo que también se les llama anaerobias facultativas o aerobias facultativas. Pueden desarrollar un metabolismo tanto respiratorio usando el oxígeno como fermentativo en ausencia de oxígeno. Las bacterias anaerobias facultativas pueden obtener energía en ausencia de oxígeno, pero el oxígeno no les es tóxico.

Las proteobacterias (Proteobacteria) son uno de los principales grupos de bacterias. Incluyen una gran variedad de patógenos, las más imporrtantes son: Escherichia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter, Neisseria gonorrhoeae y muchos otros.

Otro grupo de bacterias facultativas son de vida libre, e incluyen muchas de las bacterias responsables de la fijación del nitrógeno. El grupo se establece principalmente en términos de secuencias de ARN, y se denominan así en honor al dios griego Proteus, el cual podía cambiar de forma, dada la gran diversidad de formas encontradas en ellas.

Todas las proteobacterias son Gram negativas, con una pared celular formada principalmente de lipopolisacáridos, su morfología es muy variable.

Por Rascón Castrejón Lizeth

Las bacterias facultativas son bacterias que pueden adaptarse para crecer y metabolizar tanto en presencia como en ausencia de oxígeno, por lo que también se les llama anaerobias facultativas o aerobias facultativas. Pueden desarrollar un metabolismo tanto respiratorio usando el oxígeno como fermentativo en ausencia de oxígeno. Las bacterias anaerobias facultativas pueden obtener energía en ausencia de oxígeno, pero el oxígeno no les es tóxico.

Las proteobacterias (Proteobacteria) son uno de los principales grupos de bacterias. Incluyen una gran variedad de patógenos, las más importantes son: Escherichia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter, Neisseria gonorrhoeae y muchos otros.

Todas las proteobacterias son Gram negativas, con una pared celular formada principalmente de lipopolisacáridos, su morfología es muy variable, desde bacilos, hasta cocos simples hasta géneros con prosteca, y más e incluso cuerpos fructíferos.

Muchas de estas bacterias se mueven utilizando flagelos, pero algunas lo pueden hacer por deslizamiento bacterial. Entre estas se encuentran las mixobacterias, un grupo único de bacterias que pueden agruparse para formar cuerpos fructíferos.

Tienen también una gran variedad de tipos de metabolismo. La mayoría de las proteobacterias son anaerobias, pero hay muchas excepciones. Las mitocondrias que permiten respirar a las células eucariotas se derivan de proteobacterias, probablemente similares a las rickettsias.

La nutrición es usualmente heterótrofa, pero hay dos grupos que realizan la fotosíntesis, denominadas bacterias púrpuras. Las bacterias púrpuras del azufre usan azufre o sulfuro de hidrógeno como donante de electrones, mientras que las bacterias púrpuras no del azufre utilizan hidrógeno. Puesto que esta función no es realizada por el agua, como es común en plantas y cyanobacterias, no se produce oxígeno.

Existe un subgrupo de bacterias, denominadas de aerotolrantes como las del ácido láctico, estas, aunque pueden crecer en presencia de oxígeno, no pueden utilizarlo, sino que obtienen energía exclusivamente por fermentación.

Por Luis Diego Reyes Marcial

Relación de las bacterias con el oxígeno

En base a la relación de las bacterias con el oxígeno, estas se pueden clasificar en :

• Aerobio estricto : Un organismo el cual requiere utilizar el oxígeno como aceptador terminal de electrones.
• Anaerobio facultativo: Un organismo que puede crecer bien en ausencia del oxígeno y en la presencia de el.
• Microaerofílico : Un organismo que es capaz de un crecimiento oxígeno-dependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del oxígeno equivalente a una atmósfera de aire (oxígeno de 21%).
• Anaerobio estricto : Un organismo que es incapaz de crecimiento oxígeno-dependiente y no puede crecer en la presencia de una concentración de oxígeno equivalente a una atmósfera de aire (oxígeno de 21%).