Tinción de Hongos

Por Quistián García Hylary

Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su estudio y observación son de enorme interés.

FUNDAMENTO

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

REALIZACIÓN

Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. Esta tinción es delicada en su realización y para poder obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.

1.      Preparar los frotis bacterianos indicados.

2.      Teñir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min.

Nota: evitar que la muestra hierva. Añadir más colorante si éste se evapora; es importante que la muestra no se seque.

3.      Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

4.      Teñir con safranina 1 min.

5.      Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

6.      Secar la preparación.

7.      Observar la preparación al microscopio. 

Por Ramírez Hernández Jessica

Safranina

Útil para el estudio de cultivos y productos biológicos líquidos.  Los elementos fúngicos se tiñen de color rojo intenso, y el resto del campo toma un tono incoloro oro sapálido.

Azul de algodón 

 El azul de lacto fenol tiene tres funciones importantes a la hora de observar hongos del tipo mohos obtenidos por aislamiento de medios inoculados. El fenol destruye la flora acompañante. El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al  provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior del fúngico generando una película por así llamarlo protectora.

Es útil para realizar el examen directo de cultivos, ya que  es una técnica rápida que permite visualizar perfectamente las estructuras fúngicas.  El colorante es fuertemente ácido y se usa para la tinción directa de micelio micólico, el cual toma un delicado color azul claro.

Composición:

• Alcohol metílico 

• Azul de algodón acetico 

• Agua destilada 250 mL 

• Alcohol al 96% 

• Xilol

Anaranjado de Acridina

Se utiliza para la detección de bacterias y hongos en muestras clínicas  Puede utilizarse un microscopio con accesorios  fluorescentes como el de Reichert Zetopan. El microscopio ordinario puede equiparse con filtros  para filtración fluorescente (BG12, de 4 mm de espesor). Se colocan filtros amarillos de modo de barreras filtrantes.

Fundamento: El pigmento se intercala en el ácido nucleico (nativo y desnaturalizado). Con pH neutro, las bacterias, los hongos y el material celular se tiñen de naranja rojizo. Con pH ácido, las bacterias y los hongos se mantienen de color naranja rojizo, pero el material de fondo se tiñe de amarillo verdoso.

Composición:

×          Alcohol absoluto  

×          Ácido acético  

×          Anaranjado de acridina  

×          Buffer de fosfatos

×          Cloruro de calcio.

Tinción con Eritrosina

Útil para la observación de gránulos causados por:

• Nocardia 

• Madurellagrisea 

• M. mycetomatis

Solución de eritrosina.

Reactivos utilizados:

• Eritrocinade Grübler0.20g 

• Naranja G 1g 

• Agua destilada 100mL

Tinciones diferenciales: Son técnicas que utilizan dos o más colorantes y/o principios activos.

Tinción de Gram

Tinción diferencial: Se emplea para teñir: Productos biológicos líquidos  Exudados de lesiones  Macerados de biopsias. Todos los hongos son positivos a la coloración de Gram, excepto Cryptococcusneoformans.

 El de colorante alcohol acetona disuelve a los lípidos de la  pared impidiendo la retención del cristal violeta en los organismos Gram negativos. Se forma un complejo: lugol-cristal-violeta-ribonucleato de magnesio  Esta técnica se basa en las diferencias en el punto isoeléctrico

Tinción Ziehl – Neelsen (Ácido-Alcohol-Resistentes)

Es el procedimiento utilizado para colorear aquellos organismos que son difíciles de colorear con colorantes básicos, porque se muestran impermeables a la coloración.  El contenido lipídico de estos organismos está compuesto  principalmente por ceras y fosfolípidos que alcanzan hasta un 40% de su peso seco total. 

La ácido-alcohol-resistencia es la capacidad de ciertos materiales biológicos para formar complejos con algunos colorantes y que luego de la exposición al alcohol-ácido no ocurre de coloración Se cree que el ácido micólico es responsable de ácido- alcohol-resistencia. Útil en algunos microorganismos ácido resistentes como N.Asteroides, N.Brasiliensis y otros actinomicetes. 

ESPECIALES

Blanco de carcoflour 

Fundamento: El calcofloúr es un flourocromo que se une a polisacáridos con los en la  cesbeta1-3 y beta1-4 presentes en polímeros tales como celulosa y la quitina. El colorante  fluorece cuando se expone a una fuente de luz ultravioleta de onda cortao capaz de producir la luz azul (longitud de onda 410-450 nm). Es un método de alta sensibilidad para definir claramente los elementos micóticos con microscopio de fluorescencia.

Por Ramos Franco Michelle

Diversos productos son utilizados para la tinción de hongos, estructura fúngicas.
Los compuestos más utilizados en pruebas rutinarias se incluyen:

·         Fenol

·         Ácido láctico y azul de algodón

·         Fuesina acida

El fenol desactiva las enzimas líticas en la célula e impide que esta se rompa. Además actúa como mordiente cuando se usa en combinación con colorantes. El ácido láctico preserva las estructuras fúngicas. El azul de algodón en un colorante acido, que tiñe  el citoplasma y la quitina recenté en las células fúngicas. La fucsina acida tiñe  el citoplasma de las células

Se utiliza los colorantes

·         Rojo allura

·         Azul brillante

Para cada colorante se prepara una solución compuesta de

·         Colorante vegetal

·         Ácido acético

·         Glicerina

·         Agua destilada

Procedimiento:

1)      Se prepara la lámina con cinta engomada y necol

2)      Se coloca una gota sobre las colonias de hongos

3)      30 min después se forma una mancha transparente

4)      La mancha se colocó en una lámina portaobjetos

5)      Se colocan gotas de alcohol acetona para remover el célula acetato

6)      Se coloca 1 gota de rojo allura N.40 y azul brillante

TINCION DE HONGOS CON AZUL LACTOFENOL

·         limpiar el porta objetos en la disolución éter etílico

·         secarlo con el papel, hasta que esté totalmente seco, y no tenga éter, ya que es un alcohol y puede eliminar las bacterias existentes

1)      se coloca una gota de agua salina fisiológicamente encima del portaobjetos

2)      se aplica un trocito de hongo de la naranja podrida y se expanden por encima de la gota de agua salina fisiológica, hasta que se seque

3)      se coje una gota de azul lactorend con agua estéril y se añade encima de la muestra

4)      se cubre la muestra con el cubreobjetos y esta preparación esta lista para ser observado

Por Rascón Castrejón Lizeth

TINCIÓN DE SCHAEFFER-FULTON

Las esporas son formas de resistencia bacteriana. Tienen forma esférica u oval. Al microscopio las esporas sin teñir se observan como gránulos brillantes. Según su localización se distinguen tres tipos de esporas: Centrales, Subterminales, Terminales

• Realizar el frotis

• Cubrir el frotis con verde de malaquita

• Calentar 5 minutos a emisión de vapores

• Enjuagar con agua de la llave

• Cubrir con la Safranina dejar actuar 1 minuto

• Lavar con agua de la llave y dejar secar al aire.

TINCIONES HABITUALES (GMS, PAS)

Las tinciones habituales para hongos son la plata metenamina de Grocott (GMS) el ácido periódico de Schiff (PAS). La tinción GMS es más sensible que el PAS pero tiene el inconveniente de que tiñe las células inflamatorias (lisososmas) y la reticulina del tejido además de los hongos lo que puede causar problemas de identificación de estructuras.

La tinción de PAS tiene la ventaja de que el tejido adyacente al hongo se observa mejor, aunque esto también se puede conseguir haciendo una tinción GMS y una contra tinción con H&E. Hay que incluir buenas secciones control ya que algunos hongos, como los Mucorales, pueden requerir más tiempo de tinción y otros, por el contrario, estar sobre teñidos.

TINCION LACTOFENOL AZUL DE ALGODÓN

Método utilizado rutinariamente para la realización de preparaciones microscópicas de hongos filamentosos.

Cada uno de los constituyentes del colorantes lactofenol azul de algodón cumple una función determinada.

-El fenol utilizado sirve como funguicida

-la glicerina permite tener una preparación semipermanente

-El azul de algodón tiñe el exterior de la pared de los hongos

-El ac alcohol láctico actúa como agente a clarante

Hongos filamentosos; Aspergillux, Microsporum, Mucor , Pelicilium

Por Ríos Palacios Selene

Existen 3 tipos de tinciones para organismos fúngicos

·         Tinciones Simples

·         Tinciones Diferenciales

·         Tinciones Específicas

Tinción de Gram

• Colocar una gotita de cristal violeta sobre elfrotis, dejar interactuar 1 min. Enjuagar con agua

• Colocar una gotita de lugol durante 1 min. enjuagar con agua

• Colocar dos gotitas de etanol-acetona y enjuagar con agua

• Colocar una gotita de safranina, 30 seg., y enjuagar con agua

• dejar secar y observar a 10X, 40X y 100X ainmersión. Dibujar y colorear.

Tinción Con Naranja De Acridina

• Transferir una gota del cultivo a un portaobjetos limpio y desengrasado, dejar secar al aire.

• Fijar con etanol al 100%, cubriendo el frotis durante 5 min.

• Eliminar el etanol y colocar 100 ml de naranja de acridina durante 3min.

Eliminar el exceso del colorante con etanol al 70%.

• Observar en un microscopio de epifluorescencia con un filtro azul, emisión a 490 nm.

Tinción Diferencial

Tinción De Ziehl-Neelsen (Aar)

• Se utiliza para diferenciar las bacterias denominadas ácido alcohol resistente del No ácido alcohol resistente

• Algunas bacterias poseen, en su pared celular, ciertos ácidos grasos de cadena larga que les confiere la propiedad de resistir la decoloración con alcohol ácido, tras haber sido teñidas con colorantes básicos.

• Esta tinción requiere un calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene la capa cerosa formada por ácido micólico.