Halos de Inhibición

Por Quistián García Hylary

Un antibiótico ha sido definido como una sustancia química producida por un microorganismo capaz de inhibir el desarrollo de otros microorganismos. El aislamiento de un agente infeccioso a partir de un paciente no es con frecuencia suficiente para establecer la terapia adecuada. Muchas bacterias y algunos hongos presentan resistencia a los agentes antimicrobianos y algunos virus han desarrollado resistencia a los agentes antivirales más actuales. Los patrones de resistencia cambian en forma constante y no importa lo rápidamente que se introduzcan los nuevos agentes terapéuticos porque los microbios parecen siempre dispuestos a superarlos.

Ya que no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias, hongos y virus a los agentes antimicrobianos, con frecuencia es necesario estudiar la sensibilidad individual de cada patógeno a estas drogas, pudiéndose elegir entonces el agente apropiado, que proporciona mayores posibilidades de una evolución favorable. Por supuesto, el resultado terapéutico final depende de muchas otras variables.

En líneas generales y en función sobre su forma de actuar sobre los microorganismos, hablamos de dos grandes grupos de antibióticos

·         Antibióticos primariamente bactericidas: Ejercen una acción letal e irreversible sobre el microbio.

·         Antibióticos primariamente bacteriostáticos: Inhiben el crecimiento pero no matan al microorganismo, permitiendo que las propias defensas del huésped pueden eliminar a las bacterias.

ANTIBIOGRAMA

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico. El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las resistencias bacterianas.

Se debe realizar un antibiograma siempre que una toma bacteriológica de finalidad diagnóstica haya permitido el aislamiento de una bacteria considerada responsable de la infección.

La determinación de la Concentración Inhibidora Mínima (CIM) es la base de la medida de la sensibilidad de una bacteria a un determinado antibiótico. La CIM se define como la menor concentración de una gama de diluciones de antibiótico que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del antibiótico frente a diferentes especies bacterianas.

Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS:

·         Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un tratamiento a la dosis habitual.

·         Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento.

·         Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto terapéutico en ciertas condiciones

Ciertos mecanismos de resistencia se expresan débilmente in vitro, cuando se inscriben en el DNA bacteriano. Su expresión en el organismo, en donde las condiciones en cuanto a medios son diferentes, expondría al riesgo de fracaso terapéutico. Para evitar esto, el antibiograma debe ser interpretado de manera global a fin de descubrir, a través de la comparación de las respuestas para cada antibiótico, un mecanismo de resistencia incluso débilmente expresado. Así, gracias a la interpretación, una cepa que aparece como falsamente sensible será categorizada como I o R.

RESISTENCIA BACTERIANA

Cada antibiótico se caracteriza por un espectro natural de actividad antibacteriana. Este espectro comprende las especies bacterianas que, en su estado natural, sufren una inhibición de su crecimiento por concentraciones de su antibiótico susceptibles de ser alcanzadas in vivo.

·         La resistencia natural es un carácter constante de todas las cepas de una misma especie bacteriana. El conocimiento de las resistencias naturales permite prever la inactividad de la molécula frente a bacterias identificadas o sospechosas.

·         La resistencia adquirida es una característica propia de ciertas cepas, dentro de una especie bacteriana naturalmente sensible, cuyo patrimonio genético ha sido modificado por mutación o adquisición de genes, son evolutivas, y su frecuencia depende a menudo de la utilización de los antibióticos.

·         Una resistencia cruzada es cuando se debe a un mismo mecanismo de resistencia. En general, afecta a varios antibióticos dentro de una misma familia En ciertos casos, puede afectar a antibióticos de familias diferentes.

·         Una resistencia asociada es cuando afecta a varios antibióticos de familias diferentes. En general, se debe a la. Asociación de varios mecanismos de resistencia

Por Ramírez Hernández Jessica

La técnica actualmente utilizada para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos es el producto de importantes esfuerzos internacionales desde hace más de dos décadas enfocados a normatizar el método.

El principio del método involucra el uso de una cantidad constante de antimicrobianos en un reservorio (discos de papel) aplicado sobre la superficie del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo en cuestión. Se formará así por difusión, un gradiente de concentración del antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del reservorio. El diámetro obtenido dependerá no solo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino también del espesor de la capa del agar, su pH y composición, de la capacidad de difusión de la droga en ese medio, la temperatura, la velocidad de duplicación bacteriana, y el tamaño y fase de crecimiento del inóculo. Para que los resultados sean confiables los procedimientos deberán ser controlados y estandarizados cuidadosamente.

Las pruebas de sensibilidad están indicadas para cualquier microorganismo, contribuyendo hacia orientar el tratamiento quimioterápico de los procesos infecciosos, si su sensibilidad no puede ser predicha a partir del conocimiento de la identidad del germen.

Frecuentemente están indicadas en caso que la especie en estudio sea capaz de mostrar resistencia a los antibióticos usados comúnmente.

Las pruebas de sensibilidad pueden ser necesarias cuando aún, conociéndose la sensibilidad del germen a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicación (por ejemplo: S. pyogenes en pacientes alérgicos a la penicilina, en este caso puede probarse su sensibilidad frente a eritromicina y otros macrólidos).

El antibiograma puede ser indicado con fines epidemiológicos de resistencia y en el estudio de nuevos antibióticos. Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a partir de una cepa aislada. Se debería evitar realizar el antibiograma en forma directa a partir del material clínico, excepto en las emergencias clínicas donde la coloración directa de GRAM sugiere naturaleza monobacteriana.

REACTIVOS PARA EL TEST DE DIFUSION POR DISCO

4.1. Agar Mueller-Hinton

De los medios disponibles se considera al agar M-Hinton el mejor para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que:

• Muestra buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad .

• Contiene bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina.

• Es adecuado para el desarrollo de la mayoría de las bacterias patógenas.

• Existen suficientes datos recopilados que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad realizadas en este medio.

Aunque el agar M. Hinton es generalmente confiable para las pruebas de sensibilidad, los resultados obtenidos con algunos lotes pueden, en ocasiones, variar significativamente. Si un lote de medio no sustenta el adecuado crecimiento de los microorganismos probados, los halos obtenidos en las pruebas por difusión podrían ser mayores quedando fuera de los límites de control de calidad , conduciendo a resultados erróneos.

 4.1.1. Preparacion del agar Mueller Hinton

(1) Prepare el agar M. Hinton a partir de la base deshidratada de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.

(2) Inmediatamente después de esterilizar haga enfriar en baño de agua hasta 45-50ºC.

(3) Ponga el medio en las placas de Petri hasta un nivel aproximado de 4 mm. Esto corresponde a 60 - 70 ml de medio para placas de 150 mm. de diámetro y 25 a 30 ml. para las de 100 mm. de diámetro interno.

(4) Las placas que no se usan en el día pueden mantenerse en refrigerador (2-8 ºC.).

(5) Las placas con más de 7 días de preparación no son adecuadas para las pruebas de sensibilidad salvo que sean envueltas en bolsas de plástico para evitar la desecación, de lo contrario deberán controlarse con los microorganismos de referencia, como se especifica en la sección 9.2.

(6) Debe controlarse la esterilidad de cada lote incubando 24 horas o mas a 30-35 ºC.

Luego descarte esas muestras.

pH. El pH para cada lote debe ser controlado cuando se prepara el medio. El agar debe tener un pH 7,2 - 7,4 a temperatura ambiente y debe determinarse después de su solidificación. Si el pH es demasiado bajo, ciertas drogas (pej. Aminoglucósidos, quinolonas y macrólidos) parecerán menos activas; mientras otras (pej. tetraciclinas) parecerán tener mayor actividad. Si el pH es demasiado alto se podrían esperar los efectos opuestos.

4.1.3. Humedad

Si justo antes de usar, hay exceso de humedad en la superficie, las placas deben ser incubadas a 35ºC durante 10 - 30 min. Las placas deberán estar húmedas pero no mostrar gotas sobre la superficie del medio.

4.1.4. Efecto de la Timina o Timidina

Los medios que contienen excesiva cantidad de timina o timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima, produciendo así zonas más pequeñas, menos nítidas o sin halo lo cual puede dar como resultado un informe de falsa resistencia.

El agregado de timidina fosforilasa o sangre lisada de caballo puede mejorar la nitidez de los halos y la confiabilidad de las pruebas para sulfonamidas y trimetoprima frente a patógenos comunes, excepto para enterococos. Para evaluar cada lote de Mueller Hinton en su contenido de Timidina se debe utilizar una cepa control (Enterococcus faecalisATCC® 29212 o ATCC® 33186) que se prueba frente a discos de trimetoprima / sulfametoxazol. Un medio satisfactorio mostrará un halo de inhibición claro y definido de 20 mm o más.

4.1.5. Efectos por variación en la composición de cationes divalentes

La variación en cationes divalentes principalmente Ca++ y Mg++ afectarán los resultados con tetraciclina, colistín y aminoglucósidos frente a Ps. aeruginosa. Un excesivo contenido de cationes reducirá la zona de inhibición, mientras que bajas concentraciones de cationes resultarán en zonas de inhibición mayores que las esperadas. Un exceso de zinc podría reducir las zonas de inhibicón de los carbapenems. Las pruebas realizadas con cada lote de agar M. Hinton deben estar de acuerdo con los límites de control de la Tabla 3. Los resultados de las pruebas con las cepas patrones deben ser cuidadosamente observados para detectar cualquier valor aberrante debido a la composición de cationes del medio de cultivo.

Almacenamiento de los discos de ATB

Los discos de ATB deberán ser almacenados de la siguiente manera :

• Mantenerlos refrigerados a 8 ºC o en freezer a -14 ºC o menos, para mantener la droga en condiciones óptimas.

• Los discos que contienen drogas de la familia de antibióticos betalactámicos deben mantenerse en freezer para mantener su potencia. Los de pequeños stocks pueden mantenerse en el refrigerador.

• Los discos deben ser sacados del refrigerador o freezer 1 ó 2 horas antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la temperatura antes de ser abiertos los frascos. Este proceso evita la condensación que podría ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los frascos fríos.

• Cuando el indicador del desecador usado cambia de color debe interpretarse como un exceso de humedad y reemplazarse.

• Use solo los discos que no han sido calificados por sus fabricantes como vencidos.

4.3. Turbidez estándar para la preparación del inóculo

Para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland).

(a) Para prepararlo proceda de la siguiente manera:

(b) Prepare dicho estándar agregando 0,5 ml de BaCl2 0,048M (1,175% P/V BaCl2.2H2O) a 99,5 ml de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V).

(c) Verifique la densidad correcta del estándar usando un espectrofotómetro. La absorbancia a 625 nm debería ser 0,08 - 0,10 para el estándar 0,5 de Mc Farland.

(d) Distribuya 4 - 6 ml dentro de tubos similares a los que va a usar para preparar inóculos.

(e) Mantenga los estándares guardados a temperatura ambiente al abrigo de la luz.

(f) Agite vigorosamente el estándar antes de su uso para lograr una turbidez homogénea.

(g) Reemplace o verifique la confiabilidad de los estándares mensualmente.

Método directo de inoculación a partir de colonia aislada

<1> Como un método alternativo al descripto anteriormente el inóculo puede ser realizado en solución salina o caldo a partir de colonias seleccionadas de una placa de cultivo no selectivo de 18 a 24 horas de incubación. Inmediatamente la suspensión debe ser ajustada a la escala 0,5 de Mc Farland según los lineamientos de la sección 5.1.1.

 <2> Este método es de elección para microorganismos fastidiosos, ej: Haemophilus spp., Streptococcus spp. y Neisseria gonorrhoeae, (ver sección 6.0.) o para Staphylococcus potencialmente meticilino resistentes.

5.2. Inoculación de las placas

<1> Dentro de los 15 minutos después de ajustado el inóculo siembre las placas de M. Hinton con un hisopo estéril. Presione el hisopo contra las paredes del tubo a fin de escurrir el exceso de inóculo.

<2> Inocule la superficie seca del M. Hinton por hisopado en tres direcciones para asegurar una completa distribución del inóculo. Las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y el desarrollo confluente o casi confluente.

<3> Si crecen solo colonias aisladas el antibiograma debe repetirse. Espere de 3 a 5 minutos, pero no más de 15 min. antes de aplicar los discos para que el exceso de humedad superficial sea absorbido.

<4> NOTA: Nunca use cultivos over-nigth ni otros inóculos no estandarizados para el hisopado de las placas. Evitar extremos en la densidad del inóculo.

5.3. Aplicación de los discos de ATB en las placas inoculadas

<a> Colocar los discos sobre la superficie del agar inoculada con pinza estéril aplicando una ligera presión a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro. Debido a que algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no debe ser removido una vez que tomó contacto con la superficie del agar. No deben colocarse mas de 12 discos por placa de 150 mm y no más de 5 discos por placa de 100 mm.

<b> Incubar las placas invertidas a 35 ºC dentro de los 15 minutos posteriores a que los discos fueron aplicados. Con excepción de Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus spp. (ver sección 6), las placas no deberán ser incubadas en concentración incrementada de CO2 porque los estándares de interpretación fueron desarrollados usando incubación ambiente y el agregado de CO2 alteraría significativamente el tamaño de las zonas inhibitorias para algunos agentes antibióticos.

5.4. Lectura de las placas e interpretación de resultados

<a> Después de 16 a 18 horas de incubación examine cada placa y mida los diámetros de las zonas de inhibición. Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y el inóculo fue el correcto, las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y habrá desarrollo confluente.

Si el microorganismo estudiado es un Staphylococcus spp. o Enterococcus spp., incube 24 horas para vancomicina y oxacilina, pero los otros antimicrobianos pueden leerse entre las 16-18 hrs. Use luz transmitida para examinar un ligero crecimiento de cepas meticilino o vancomicina resistentes dentro de las zonas de inhibición. Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibición es indicativo de meticilino o vancomicina resistencia.

Por Ramos Franco Michelle

Es la zona alrededor de un disco de antibiótico en un antibiograma en el que no se produce crecimiento bacteriano en una placa de agar inoculado con el germen.

Es una medida de la potencia de antibiótico frente al germen

Una vez completado este proceso, la placa se coloca en estufa de cultivo y comienza, por un lado, el crecimiento de la bacteria y comienza, por el otro, la difusión del antibiótico desde el disco de papel

El antibiótico se aleja del disco según un gradiente de dilución, de modo que, a mayor distancia, menor concentración.

Esto da lugar a que, determinada distancia del disco de papel la dilución del antibiótico no alcance a inhibidora el crecimiento de la bacteria y que se formo un lado de inhibición circular

Cuyo diámetro será directamente proporcional del antibacteriano frente a la bacteria en cuestión e inversamente proporcional a la concentración inhibitoria mínima (CIM) del agente antimicrobiano

La medición del halo de inhibición

Por la parte trasera de la placa incubada mediremos el diámetro de los halos de inhibición que se han formado alrededor de los discos de antibiótico a los que la bacteria “problema es sensible”

Por Luis Diego Reyes Marcial

Antibiograma.

El antibiograma, son métodos in vitro que determinan la susceptibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes microbianos, bajo condiciones de laboratorio especificas y estandarizadas.

Método Kirby-Bauer

Es una prueba de inhibición que se emplea para determinar la sensibilidad de un agente microbiano frente a un antibiótico o quimioterápico. Se aplica sobre una placa de agar Muller-Hinton, se inocula y se colocan discos de papel filtro impregnados con antibióticos.

Inhibición

El tamaño del halo de inhibición de desarrollo variará en base a los siguientes parámetros o variables:

• Concentración de la droga
•  Sensibilidad bacteriana
• Coeficiente de difusión de la droga
• Tiempo y temperatura de incubación
• pH y composición del medio
• Profundidad del medio
• Tamaño del inóculo

Categorías de interpretación

Sensible: el microorganismo presenta una gran área de inhibición causada por el fármaco.

Intermedio: se presenta un halo de inhibición más reducido.

Resistente: presenta muy poco o casi nada de halo.

Medición de los halos

Después de incubar las placas del antibiograma se procede a su lectura. Se usa una regla y se mide el radio del halo de inhibición partiendo desde donde está el disco de antibiótico hasta donde se inhibió el crecimiento. La longitud obtenida después se compararán con estándares que nos dirán si el medicamento será efectivo o no en el tratamiento.