Métodos y Técnicas de Tinción

Por Quistián Hylary

La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo. De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:

·         Simple: el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.

·         Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre partes de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción.

Los colorantes más usados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos son catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso conocido como fijación. Después de esta habitualmente se realiza la tinción. La fijación produce generalmente encogimiento de las células, la tinción por el contrario, hace que las células parezcan mayores de lo que son realmente.

Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de manera que ahora sí podrá atacar el colorante.

Tinción de Gram

1)      Las células son fijadas por medio del calor sobre un portaobjetos, se tiñen primero con una solución de cristal violeta y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este punto las células Gram positivas y Gram negativas, están teñidas de azul/violeta.

2)      El portaobjetos se cubre con una solución de yodo-yoduro potásico. El KI hace soluble el I₂ en agua. El I₂ entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. En este punto las células se mantienen iguales.

3)      Se inicia con la decoloración usando una solución de Alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I₂-Cristal violeta. Algunos microorganismos no se decoloran. La diferencia esencial entre los dos tipos de células es la resistencia que presentan ante la decoloración.

Después de la decoloración las células Gram positivas son azul\violeta, y las Gram negativas son incoloras.

4)      Para poner de manifiesto las células Gram Negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es de color rojo, como la safranina.

Tinción ácido-alcohol resistencia

1)      Se coloca sobre el portaobjetos una mezcla de fucsia-fenol, en la que la  fucsia  hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido-alcohol-sensibles como las resistentes.

2)      Se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido-alcohol sensibles se decoloren mientras que las acido-alcohol resistentes permanecen rosas.

3)      Se utiliza un colorante de contraste, como el azul de metileno.

Tinción de Esporas

1)      Sobre el portaobjetos con la preparación se coloca “verde malaquita” que tiñe las células de verde.

2)      Se lava con agua destilada con lo que las células quedan incoloras y las esporas verdes.

3)      Se usa safranina para obtener bacterias de color rojo/rosa mientras que las endoesporas continúan verdes.

      

Por Ramírez Jessica

La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste. En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol, formaldehido y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares. Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente, en ella un colorante se une aciertas estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados en microbiología tienen en común la presencia de grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los responsables del color mediante la unión a estructuras celulares por enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos, los que establecen enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre los colorantes que se unen por enlaces covalentes destaca el reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de DNA, donde el colorante se une a la desoxi-ribosa. Por otra parte, en la tinción negativa

se utilizan compuestos que no penetran en las células sino que impregnan el medio circundante. Los microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro.

OBSERVACIÓN “IN VIVO”

Método de la gota pendiente.

Este procedimiento es la forma más sencilla de observación de organismos vivos, nos proporciona información sobre la morfología, tamaño, color y movilidad de las bacterias. Sin embargo, debido a la falta de contraste con el entorno es una práctica que se utiliza únicamente para la observación del movimiento.

Material necesario

Cultivos bacterianos de Escherichia coli y Pseudomonas sp.en medios de cultivo líquido (caldo triptona soja), vaso lavador, portaobjetos excavado, cubreobjetos, asa  de siembra, pipeta Pasteur, aceite de inmersión.

Procedimiento

·Tomar una gota de un cultivo líquido reciente (24 horas) usando unasa de siembra o una pipeta Pasteur estéril.

·Colocar en el centro de un cubreobjetos y añadir cuatro pequeñas gotas de aceite en los cuatro extremos.

Colocar el portaobjetos excavado sobre el cubreobjetos, cuidando que la gota quede situada en el centro de la depresión.

·Dar la vuelta al portaobjetos.

·Colocar una gota de aceite de inmersión y observar con objetivo de inmersión (100x).

Esta técnica permite observar el desplazamiento rápido y rectilíneo o dando giros y volteretas en aquellas bacterias que tienen flagelos (Video complementario). Las bacterias inmóviles presentan un movimiento vibratorio denominado movimiento browniano, debido al choque de las moléculas enuna solución líquida.

Método de observación directa en contraste de fases o interferencia diferencial. En este caso la suspensión de microorganismos se observa con un microscopio de contraste de fases o interferencia diferencial (DIC) que permiten el aumento del contraste. El microscopio de contraste de fases utiliza un condensador con un diafragma anular opaco con un anillo transparente que provocan variación de la longitud de onda dependientes de la densidad y el índice de refracción de la muestra, se observan las células más brillantes sobre un fondo oscuro. El microscopio de interferencia diferencial permite la observación tridimensional de la muestra por la incorporación de prismas que generan haces de luz polarizada que se cruzan, incrementando las diferencias entre los componentes celulares por lo que es muy útil para la observación de esporas, inclusiones, filamentos septados o vainas entre otros.

Material necesario

Cultivos bacterianos en medio líquido, portaobjetos y cubreobjetos, pipetas Pasteur, aceite de inmersión.

Procedimiento

Se deposita una gota de la muestras obre un cubreobjetosy se coloca encima un portaobjetos excavado. La preparación se observa directamente al microscopio decontraste de fases o de DIC.Reduca (Biología). Serie Microbiología.3 (5): 15-38, 2010ISSN: 1989-362018. Observación de Zooglea ramigeray bacterias filamentosas. Microscopía de Interferencia diferencial (100x).Observación de Anabaenasp., cianobacteria filamentosa. Microscopía de contraste de fases (100x).

TINCIONES

Tinción negativa

No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con cromóforos, ni se lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los colorantes. En este caso el frotis se hace con una gota de una solución de nigrosina o tinta china, ambos son productos particulados, insolubles, que formarán una película opaca a la luz. En este tipo de tinción se prescinde de la fijación por calor, se deja secar la preparación y se observan los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.

Tinción simple

La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán.

Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes básicos. Otros colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina, fuchina básica y verde malaquita.

Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen un pH interno próxima la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada negativamente, así los colorantes básicos son los más eficaces.

Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fuchina ácida tiene un cromóforo cargado negativamente y son utilizados para teñir positivamente ciertos componentes como las proteínas.

Material necesario

Cultivos bacterianos de Staphylococcusaureus y Micrococcus luteus, frasco lavador, cristalizador, soporte y colorantes (safranina y cristal violeta), asa de siembra, aceite de inmersión.

Procedimiento

·Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota

de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.

·Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el

asa de siembra. Dejar secar.

·Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.

·Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1 minuto.

·Lavar el exceso de colorante con agua.

·Dejar secar al aire.

·Añadir una gota de aceite de inmersión.

·Observar con objetivo de inmersión (100 x).

La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma, tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y rápido.

TINCIÓN DIFERENCIAL

Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas células dentro de una población. La diferenciación puede ser provocada por un agente químico o físico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes a la tinción en una misma muestra. Las dos tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología son la tinción de gram y la tinción de ácido alcohol resistencia.

Tinción de Gram Esta tinción diferencial fue propuesta por el medico danés Christian Gram(1884)(TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos fallecidos por neumonía observó que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en los pulmones, retenía el colorante conocido como marrón Bismark(sustituido posteriormente por el cristal violeta),mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante.

Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información esencial, además de sobre la forma, tamaño y agrupación celular, como es el tipo y composición de la pared que presentan las bacterias. La tinción de  Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo gram positiva y bacterias con pared de tipo gram negativa.

Material necesario

Cultivos de bacterias gram positivas: Bacillus cereusy.

 Gram negativas: Escherichia coli, frasco lavador, cristalizador, soporte, portaobjetos, asa de siembra, cristal violeta, safranina, lugol y alcohol, aceite de inmersión.

Procedimiento

·Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.

·Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de siembra. Dejar secar.

·Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.

·Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.

·Lavar el exceso de colorante con agua.

·Añadir el mordiente lugol, solución de yodo -ioduro potásico, durante 1 minuto.

·Lavar el exceso de mordiente con agua.

·Lavar la preparación con alcohol formando un ángulo con la preparación, durante 30 segundos (el tiempo de decoloración es clave para un resultado correcto).

·Lavar inmediatamente con abundante agua.

·Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto.

·Lavar el exceso de colorante con agua.

·Dejar secar al aire.

·Añadir una gota de aceite de inmersión.

·Observar con objetivo de inmersión (100 x).

La diferente estructura y organización de la pared celular en estos dos tipos de organismos hace que ambos grupos respondan de manera distinta, así mientras las bacterias Gram positivas mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias Gram negativas se decoloran rápidamente con la aplicación del alcohol, admitiendo el colorante de contraste que proporciona un color entre rosa y rojo que contrasta con el intenso color violeta.

Se han propuesto diferentes explicaciones para justificar la respuesta de los microorganismos a esta tinción, parece que la diferencia se debe tanto a la estructura física como a la composición de la pared celular, en bacterias Gram positivas la gruesa capa de péptidoglucano con abundantes entrecruzamientos parece contribuirá la retención del colorante fundamental, cristal violeta, mientras que en bacterias Gram negativas la delgada capa de peptidoglucano junto con la abundancia de lípidos en la membrana externa de la pared celular incrementan la porosidad y por ello, contribuyen a la pérdida del colorante fundamental después de la decoloración con alcohol.

Tinción de ácido-alcohol resistencia

Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-alcohol resistentes).

Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes patógenos: Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente.

 Por Ramos Michelle

Tinción Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).

·         El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.

·         La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.

·         En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta china.

Tinción Diferencial

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química.

Los ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen

En la imagen: BGN y levaduras en una tinción GRAM

Tinción GRAM: Morfología Bacteriana

Ya hemos visto que la tinción de GRAM aporta dos ideas básicas para la deficinión "taxonómica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tinción y la forma que presentan las células bacterianas.

En lo relativo a la coloración, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.

Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción GRAM:

Cocos

Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamaño

Bacilos

grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Utilizamos el término Pleomorfismo para referirnos a la adopción de diferentes formas en una misma especie.

Por Rangel Hugo

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso para resaltar organelas dentro de células individuales.

En bioquímica, esto implica agregar un colorante específico (esto significa que se una de manera selectiva ya sea a ADN, proteínas, lípidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Tanto la tinción como el marcado fluorescente pueden servir para los mismos propósitos.

Tinción de Gram

También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las células, un proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más extensamente utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están eñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células gram positivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas mientras que las grampositivas permanecen azules.

Tinción negativa

Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Por Rascón Lizeth

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes son sustancias que usualmente se utilizan para aumentar la definición y examinar poblaciones celulares.

Tipos de técnicas de tinción

Tinciones simples

Se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada.

Tinciones diferenciales

Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una tinción simple seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología.

Tinciones específicas

Se utilizan para incrementar el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las cápsulas.

Tinción adecuada

En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la muestra en la solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante y la observación. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente. Cuando la solución de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tinción mordentada permanece.

Tinción negativa:

Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro caso de cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los métodos de tinción positiva fallan, es la tinción negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser observados fácilmente por medio de microscopía en campo claro como inclusiones claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea

Tinción indirecta:

Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente habitual es el ácido tánico.

Tinción directa:

Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro tratamiento previo.

Tinción Gram:

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico. Su utilidad en la práctica de referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM

1. Se tiñe el espécimen con el primer colorante, cristal violeta.

2. Se añade el mordiente, yodo.

3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solución de acetona o etanol. En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante.

4. Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta más intenso.

Una tinción ácido-alcohol resistente se realiza según los siguientes pasos:

1. Tinción primaria con fucsina básica, que tiñe todas las células de rojo.

2. Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante en el interior de la célula.

3. Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Este decolorante elimina la fucsina de todas las células excepto de las micro bacterias, que la retienen debido a su superficie cérea.

4. Coloración de contraste con azul de metileno. Se tiñen de azul todas las células previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de Mycobacterum, aún teñidas de rojo, v las células restantes del espécimen.

Tinción: RODAMINA-AURAMINA

Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes.

Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica.

Tinción: NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción.

Colorantes:
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.

Azul de metileno: El azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer más visibles sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser utilizados en citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos.

Azul Nilo: Tiñe los núcleos de color azul. También puede ser utilizado para teñir células vivas.

Cristal violeta: El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe las paredes celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloración de Gram.

Eosina: La eosina se utiliza más frecuentemente como contra coloración de la hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al material citoplasmático, membrana celular, y algunas estructuras extracelulares. Además imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada también en algunas variantes de la coloración de Gram, y en muchos otros protocolos de tinción.

Safranina: La safranina es un colorante nuclear. Colorea los núcleos celulares de rojo, y se utiliza principalmente como contracoloración. También puede ser utilizada para darle una coloración amarilla al colágeno.

Verde de metilo; El verde de metilo se utiliza frecuentemente en microscopia de campo claro, para teñir la cromatina de las células y facilitar así su visualización.

Por Reyes Diego

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.

Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos. Tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción.

Conceptos básicos.

      Tinción primaria: es el colorante principal que se va usar para teñir en un principio a las células.

      Mordiente: es la sustancia que sirve para fijar los colorantes en la tinción.

      Agente decolorante: es como su nombre lo indica, el agente que ayuda a decolorar una parte de las células que se han teñido.

      Tinción de contraste: es la sustancia que contra tiñe las células que han sido previamente decoloradas y además le da un color diferente de la primera vez que se tiño. 

Tinciones para microbiología.

      Tinción de Gram.

      Tinción de Ziehl-Neelsen

      Tinción de Schaeffer-Fulton

      Tinción de Conklin

      Tinción de Grocott

      Tinción de Dieterle

      Tinción negativa

      Tinción con mucicarmina

Tinción simple.

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad.

El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.

La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.

Tinción de Gram

También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las células, un proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más extensamente utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.

Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante.

En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración.

Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas mientras que las grampositivas permanecen azules.

Tinción ácido – alcohol resistencia

Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser calificadas por la tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles como las resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido – alcohol sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células ácido – alcohol sensibles de color azul quedando las células ácido – alcohol resistentes de color rosa.

Tinción de esporas

Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas.

Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las células de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las células se quedan incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continúan con su color verde de la verde malaquita.

Tinción negativa

Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad con los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Por Rios Selene

Las tinciones se usan para tres cosas fundamentalmente:

·         Descripción de microorganismos en base a su morfología, estructura y distribución.

·         Detección de determinados microorganismos para diagnostico clínico, por ejemplo.

·         Clasificación de microorganismos según sus características tintoriales.

Tipos de colorantes:

Ácidos:

·         En disolución se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas positivamente y no las células, que tienen carga negativa.

·         Sales de Na. K, Ca, ión amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina ácida...

Básicos:

·         En disolución se cargan positivamente uniéndose a estructuras con carga negativa como las células.

·         Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina fenicada o carbol-fucsina.

Características de un cultivo para una buena tinción:

·         Ha de estar en fase exponencial de crecimiento y no ser viejo.

·         Debe haberse obtenido de un cultivo sólido, para tinciones simples puede ser necesario usar un cultivo liquido.

Preparación de un frotis:

·         Suspensión de una colonia de un cultivo puro en una gota de agua

·         Extensión de la gota en un porta, con ayuda de otro porta, en la parte central del primero.

·         Secado al aire.

·         Fijación a la llama para deshidratar la muestra. Se hace pasando tres veces el porta por la llama rápidamente.

Tipos de tinciones:

·         Simples: se usa un solo colorante disuelto en solución acuosa o alcohólica, y se suplementan con un mordiente para una mejor fijación del colorante además de aumentar el grosor de algunas estructuras para su mejor visión. Sirven para ver la morfología y las agrupaciones que forman los microorganismos entre ellos y con otras células.

·         Diferenciales: Se usa mas de un colorante. Tiñe de diferente modo a las células de distintas especies.

TINCIÓN DE GRAM

Es la más importante en bacteriología. Gracias a ella distinguimos dos tipos de bactrias:

§  Gram +. Son aquellas que se tiñen con cristal violeta (colorante primario)

§  Gram -. Son aquellas que se tiñen con safranina (colorante secundario)

Las gram + aparecerán violetas, y las gram – aparecerán rosas. Las diferencias entre + y – obedecen a la estructura de su pared celular:

Las gram + tienen una pared muy gruesa que contiene muy pocos lípidos, mientras que las gram – son muy delgadas y contienen gran cantidad de lípidos.