miércoles, 29 de octubre de 2014

Métodos y Técnicas de Tinción

Por Quistián Hylary
La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo. De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:
·         Simple: el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.
·         Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre partes de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción.
Los colorantes más usados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos son catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso conocido como fijación. Después de esta habitualmente se realiza la tinción. La fijación produce generalmente encogimiento de las células, la tinción por el contrario, hace que las células parezcan mayores de lo que son realmente.
Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de manera que ahora sí podrá atacar el colorante.
Tinción de Gram
1)      Las células son fijadas por medio del calor sobre un portaobjetos, se tiñen primero con una solución de cristal violeta y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este punto las células Gram positivas y Gram negativas, están teñidas de azul/violeta.
2)      El portaobjetos se cubre con una solución de yodo-yoduro potásico. El KI hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. En este punto las células se mantienen iguales.
3)      Se inicia con la decoloración usando una solución de Alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-Cristal violeta. Algunos microorganismos no se decoloran. La diferencia esencial entre los dos tipos de células es la resistencia que presentan ante la decoloración.
Después de la decoloración las células Gram positivas son azul\violeta, y las Gram negativas son incoloras.
4)      Para poner de manifiesto las células Gram Negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es de color rojo, como la safranina.
Tinción ácido-alcohol resistencia
1)      Se coloca sobre el portaobjetos una mezcla de fucsia-fenol, en la que la  fucsia  hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido-alcohol-sensibles como las resistentes.
2)      Se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido-alcohol sensibles se decoloren mientras que las acido-alcohol resistentes permanecen rosas.
3)      Se utiliza un colorante de contraste, como el azul de metileno.
Tinción de Esporas
1)      Sobre el portaobjetos con la preparación se coloca “verde malaquita” que tiñe las células de verde.
2)      Se lava con agua destilada con lo que las células quedan incoloras y las esporas verdes.
3)      Se usa safranina para obtener bacterias de color rojo/rosa mientras que las endoesporas continúan verdes.
      
Por Ramírez Jessica
La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste. En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol, formaldehido y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares. Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente, en ella un colorante se une aciertas estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados en microbiología tienen en común la presencia de grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los responsables del color mediante la unión a estructuras celulares por enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos, los que establecen enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre los colorantes que se unen por enlaces covalentes destaca el reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de DNA, donde el colorante se une a la desoxi-ribosa. Por otra parte, en la tinción negativa
se utilizan compuestos que no penetran en las células sino que impregnan el medio circundante. Los microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro.
OBSERVACIÓN “IN VIVO”
Método de la gota pendiente.
Este procedimiento es la forma más sencilla de observación de organismos vivos, nos proporciona información sobre la morfología, tamaño, color y movilidad de las bacterias. Sin embargo, debido a la falta de contraste con el entorno es una práctica que se utiliza únicamente para la observación del movimiento.
Material necesario
Cultivos bacterianos de Escherichia coli y Pseudomonas sp.en medios de cultivo líquido (caldo triptona soja), vaso lavador, portaobjetos excavado, cubreobjetos, asa  de siembra, pipeta Pasteur, aceite de inmersión.
Procedimiento
·Tomar una gota de un cultivo líquido reciente (24 horas) usando unasa de siembra o una pipeta Pasteur estéril.
·Colocar en el centro de un cubreobjetos y añadir cuatro pequeñas gotas de aceite en los cuatro extremos.
Colocar el portaobjetos excavado sobre el cubreobjetos, cuidando que la gota quede situada en el centro de la depresión.
·Dar la vuelta al portaobjetos.
·Colocar una gota de aceite de inmersión y observar con objetivo de inmersión (100x).
Esta técnica permite observar el desplazamiento rápido y rectilíneo o dando giros y volteretas en aquellas bacterias que tienen flagelos (Video complementario). Las bacterias inmóviles presentan un movimiento vibratorio denominado movimiento browniano, debido al choque de las moléculas enuna solución líquida.
Método de observación directa en contraste de fases o interferencia diferencial. En este caso la suspensión de microorganismos se observa con un microscopio de contraste de fases o interferencia diferencial (DIC) que permiten el aumento del contraste. El microscopio de contraste de fases utiliza un condensador con un diafragma anular opaco con un anillo transparente que provocan variación de la longitud de onda dependientes de la densidad y el índice de refracción de la muestra, se observan las células más brillantes sobre un fondo oscuro. El microscopio de interferencia diferencial permite la observación tridimensional de la muestra por la incorporación de prismas que generan haces de luz polarizada que se cruzan, incrementando las diferencias entre los componentes celulares por lo que es muy útil para la observación de esporas, inclusiones, filamentos septados o vainas entre otros.
Material necesario
Cultivos bacterianos en medio líquido, portaobjetos y cubreobjetos, pipetas Pasteur, aceite de inmersión.
Procedimiento
Se deposita una gota de la muestras obre un cubreobjetosy se coloca encima un portaobjetos excavado. La preparación se observa directamente al microscopio decontraste de fases o de DIC.Reduca (Biología). Serie Microbiología.3 (5): 15-38, 2010ISSN: 1989-362018. Observación de Zooglea ramigeray bacterias filamentosas. Microscopía de Interferencia diferencial (100x).Observación de Anabaenasp., cianobacteria filamentosa. Microscopía de contraste de fases (100x).
TINCIONES
Tinción negativa
No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con cromóforos, ni se lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los colorantes. En este caso el frotis se hace con una gota de una solución de nigrosina o tinta china, ambos son productos particulados, insolubles, que formarán una película opaca a la luz. En este tipo de tinción se prescinde de la fijación por calor, se deja secar la preparación y se observan los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.
Tinción simple
La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán.
Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes básicos. Otros colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina, fuchina básica y verde malaquita.
Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen un pH interno próxima la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada negativamente, así los colorantes básicos son los más eficaces.
Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fuchina ácida tiene un cromóforo cargado negativamente y son utilizados para teñir positivamente ciertos componentes como las proteínas.
Material necesario
Cultivos bacterianos de Staphylococcusaureus y Micrococcus luteus, frasco lavador, cristalizador, soporte y colorantes (safranina y cristal violeta), asa de siembra, aceite de inmersión.
Procedimiento
·Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota
de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
·Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el
asa de siembra. Dejar secar.
·Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.
·Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1 minuto.
·Lavar el exceso de colorante con agua.
·Dejar secar al aire.
·Añadir una gota de aceite de inmersión.
·Observar con objetivo de inmersión (100 x).
La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma, tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y rápido.
TINCIÓN DIFERENCIAL
Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas células dentro de una población. La diferenciación puede ser provocada por un agente químico o físico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes a la tinción en una misma muestra. Las dos tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología son la tinción de gram y la tinción de ácido alcohol resistencia.
Tinción de Gram Esta tinción diferencial fue propuesta por el medico danés Christian Gram(1884)(TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos fallecidos por neumonía observó que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en los pulmones, retenía el colorante conocido como marrón Bismark(sustituido posteriormente por el cristal violeta),mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante.
Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información esencial, además de sobre la forma, tamaño y agrupación celular, como es el tipo y composición de la pared que presentan las bacterias. La tinción de  Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo gram positiva y bacterias con pared de tipo gram negativa.
Material necesario
Cultivos de bacterias gram positivas: Bacillus cereusy.
 Gram negativas: Escherichia coli, frasco lavador, cristalizador, soporte, portaobjetos, asa de siembra, cristal violeta, safranina, lugol y alcohol, aceite de inmersión.
Procedimiento
·Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
·Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de siembra. Dejar secar.
·Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.
·Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.
·Lavar el exceso de colorante con agua.
·Añadir el mordiente lugol, solución de yodo -ioduro potásico, durante 1 minuto.
·Lavar el exceso de mordiente con agua.
·Lavar la preparación con alcohol formando un ángulo con la preparación, durante 30 segundos (el tiempo de decoloración es clave para un resultado correcto).
·Lavar inmediatamente con abundante agua.
·Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto.
·Lavar el exceso de colorante con agua.
·Dejar secar al aire.
·Añadir una gota de aceite de inmersión.
·Observar con objetivo de inmersión (100 x).
La diferente estructura y organización de la pared celular en estos dos tipos de organismos hace que ambos grupos respondan de manera distinta, así mientras las bacterias Gram positivas mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias Gram negativas se decoloran rápidamente con la aplicación del alcohol, admitiendo el colorante de contraste que proporciona un color entre rosa y rojo que contrasta con el intenso color violeta.
Se han propuesto diferentes explicaciones para justificar la respuesta de los microorganismos a esta tinción, parece que la diferencia se debe tanto a la estructura física como a la composición de la pared celular, en bacterias Gram positivas la gruesa capa de péptidoglucano con abundantes entrecruzamientos parece contribuirá la retención del colorante fundamental, cristal violeta, mientras que en bacterias Gram negativas la delgada capa de peptidoglucano junto con la abundancia de lípidos en la membrana externa de la pared celular incrementan la porosidad y por ello, contribuyen a la pérdida del colorante fundamental después de la decoloración con alcohol.
Tinción de ácido-alcohol resistencia
Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-alcohol resistentes).
Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes patógenos: Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente.

 Por Ramos Michelle
Tinción Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
·         El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
·         La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.
·         En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta china.
Tinción Diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química.
Los ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen
En la imagen: BGN y levaduras en una tinción GRAM


Tinción GRAM: Morfología Bacteriana
Ya hemos visto que la tinción de GRAM aporta dos ideas básicas para la deficinión "taxonómica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tinción y la forma que presentan las células bacterianas.
En lo relativo a la coloración, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.
Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción GRAM:
Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamaño
Bacilos
grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos
Espirales (Treponemas, Borrelias ...)
Utilizamos el término Pleomorfismo para referirnos a la adopción de diferentes formas en una misma especie.
Por Rangel Hugo
Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso para resaltar organelas dentro de células individuales.
En bioquímica, esto implica agregar un colorante específico (esto significa que se una de manera selectiva ya sea a ADN, proteínas, lípidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Tanto la tinción como el marcado fluorescente pueden servir para los mismos propósitos.
Tinción de Gram
También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las células, un proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más extensamente utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están eñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células gram positivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas mientras que las grampositivas permanecen azules.
Tinción negativa
Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.
Por Rascón Lizeth

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes son sustancias que usualmente se utilizan para aumentar la definición y examinar poblaciones celulares.

Tipos de técnicas de tinción
Tinciones simples
Se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada.
Tinciones diferenciales
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una tinción simple seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología.
Tinciones específicas
Se utilizan para incrementar el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las cápsulas.
Tinción adecuada
En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la muestra en la solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante y la observación. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente. Cuando la solución de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tinción mordentada permanece.
Tinción negativa:
Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro caso de cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los métodos de tinción positiva fallan, es la tinción negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser observados fácilmente por medio de microscopía en campo claro como inclusiones claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea
Tinción indirecta:
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente habitual es el ácido tánico.
Tinción directa:
Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro tratamiento previo.
Tinción Gram:
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico. Su utilidad en la práctica de referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM
1. Se tiñe el espécimen con el primer colorante, cristal violeta.
2. Se añade el mordiente, yodo.
3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solución de acetona o etanol. En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante.
4. Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta más intenso.
Una tinción ácido-alcohol resistente se realiza según los siguientes pasos:
1. Tinción primaria con fucsina básica, que tiñe todas las células de rojo.
2. Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante en el interior de la célula.
3. Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Este decolorante elimina la fucsina de todas las células excepto de las micro bacterias, que la retienen debido a su superficie cérea.
4. Coloración de contraste con azul de metileno. Se tiñen de azul todas las células previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de Mycobacterum, aún teñidas de rojo, v las células restantes del espécimen.
Tinción: RODAMINA-AURAMINA
Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica.
Tinción: NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción.
Colorantes:
La mayoría de los 
colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.
Azul de metileno: El azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer más visibles sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser utilizados en citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos.
Azul Nilo: Tiñe los núcleos de color azul. También puede ser utilizado para teñir células vivas.
Cristal violeta: El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe las paredes celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloración de Gram.
Eosina: La eosina se utiliza más frecuentemente como contra coloración de la hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al material citoplasmáticomembrana celular, y algunas estructuras extracelulares. Además imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada también en algunas variantes de la coloración de Gram, y en muchos otros protocolos de tinción.
Safranina: La safranina es un colorante nuclear. Colorea los núcleos celulares de rojo, y se utiliza principalmente como contracoloración. También puede ser utilizada para darle una coloración amarilla al colágeno.
Verde de metilo; El verde de metilo se utiliza frecuentemente en microscopia de campo claro, para teñir la cromatina de las células y facilitar así su visualización.
Por Reyes Diego
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos. Tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción.
Conceptos básicos.
*      Tinción primaria: es el colorante principal que se va usar para teñir en un principio a las células.
*      Mordiente: es la sustancia que sirve para fijar los colorantes en la tinción.
*      Agente decolorante: es como su nombre lo indica, el agente que ayuda a decolorar una parte de las células que se han teñido.
*      Tinción de contraste: es la sustancia que contra tiñe las células que han sido previamente decoloradas y además le da un color diferente de la primera vez que se tiño. 
Tinciones para microbiología.
*      Tinción de Gram.
*      Tinción de Ziehl-Neelsen
*      Tinción de Schaeffer-Fulton
*      Tinción de Conklin
*      Tinción de Grocott
*      Tinción de Dieterle
*      Tinción negativa
*      Tinción con mucicarmina
Tinción simple.
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad.
El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.
Tinción de Gram
También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las células, un proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más extensamente utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.
Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante.
En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración.
Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas mientras que las grampositivas permanecen azules.

Tinción ácido – alcohol resistencia
Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser calificadas por la tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles como las resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido – alcohol sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células ácido – alcohol sensibles de color azul quedando las células ácido – alcohol resistentes de color rosa.
Tinción de esporas
Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas.
Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las células de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las células se quedan incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continúan con su color verde de la verde malaquita.
Tinción negativa
Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad con los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.
Por Rios Selene
Las tinciones se usan para tres cosas fundamentalmente:

·         Descripción de microorganismos en base a su morfología, estructura y distribución.
·         Detección de determinados microorganismos para diagnostico clínico, por ejemplo.
·         Clasificación de microorganismos según sus características tintoriales.
Tipos de colorantes:
Ácidos:
·         En disolución se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas positivamente y no las células, que tienen carga negativa.
·         Sales de Na. K, Ca, ión amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina ácida...
Básicos:
·         En disolución se cargan positivamente uniéndose a estructuras con carga negativa como las células.
·         Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina fenicada o carbol-fucsina.

Características de un cultivo para una buena tinción:
·         Ha de estar en fase exponencial de crecimiento y no ser viejo.
·         Debe haberse obtenido de un cultivo sólido, para tinciones simples puede ser necesario usar un cultivo liquido.
Preparación de un frotis:
·         Suspensión de una colonia de un cultivo puro en una gota de agua
·         Extensión de la gota en un porta, con ayuda de otro porta, en la parte central del primero.
·         Secado al aire.
·         Fijación a la llama para deshidratar la muestra. Se hace pasando tres veces el porta por la llama rápidamente.
Tipos de tinciones:
·         Simples: se usa un solo colorante disuelto en solución acuosa o alcohólica, y se suplementan con un mordiente para una mejor fijación del colorante además de aumentar el grosor de algunas estructuras para su mejor visión. Sirven para ver la morfología y las agrupaciones que forman los microorganismos entre ellos y con otras células.
·         Diferenciales: Se usa mas de un colorante. Tiñe de diferente modo a las células de distintas especies.
TINCIÓN DE GRAM
Es la más importante en bacteriología. Gracias a ella distinguimos dos tipos de bactrias:
§  Gram +. Son aquellas que se tiñen con cristal violeta (colorante primario)
§  Gram -. Son aquellas que se tiñen con safranina (colorante secundario)
Las gram + aparecerán violetas, y las gram – aparecerán rosas. Las diferencias entre + y – obedecen a la estructura de su pared celular:
Las gram + tienen una pared muy gruesa que contiene muy pocos lípidos, mientras que las gram – son muy delgadas y contienen gran cantidad de lípidos.

65 comentarios:

  1. excelente faltarian las fuentes nada mas :/

    ResponderEliminar
  2. Gracias por tenerlo, me han ayudado a mi tarea

    ResponderEliminar
  3. Muy buen artículo , pero necesito saber quien publico el articulo gracias.

    ResponderEliminar
  4. muy buena informacion y de forma sencilla

    ResponderEliminar
  5. Excelente información, muchas gracias 😊

    ResponderEliminar
  6. ¿Alguien sabe donde puedo encontrar las fuentes?

    ResponderEliminar
  7. 좋은 게시물! 이것은 내가 올해 더 많이 다시 올 수있는 아주 멋진 블로그입니다! 유익한 게시물 주셔서 감사합니다 먹튀검증

    ResponderEliminar
  8. Trying to say thanks won't simply be adequate, for the fantasti c clarity in your written work. I will immediately snatch your rss channel to remain educated of any updates. 먹튀사이트

    ResponderEliminar
  9. I got too much interesting stuff on your blog. I guess I am not the only one having all the enjoyment here! Keep up the good work windshield crack repair

    ResponderEliminar
  10. This is an interesting post that I'll like to share with you motorcycles for sale san diego

    ResponderEliminar
  11. Thanks for sharing this interesting blog with us.My pleasure to being here on your blog..I wanna come beck here for new post from your site yamaha dealer

    ResponderEliminar
  12. I want you to thank for your time of this wonderful read !!! I definately enjoy every little bit of it and I have you bookmarked to check out new stuff of your blog a must read blog ktm dealer

    ResponderEliminar
  13. Thank you for your post, I look for such article along time, today i find it finally. this post give me lots of advise it is very useful for me Mechanic Near Me

    ResponderEliminar
  14. I invite you to the page where you can read       with interesting information on similar topics Used Car Dealorship Berkshire

    ResponderEliminar
  15. I am going to click on this to learn about assignmentexpert soon. If I can learn about this now, it will help me in my projects, and that is vital for me. Airport Transfer Service

    ResponderEliminar
  16. I recently came across your blog and have been reading along. I thought I would leave my first comment. I don't know what to say except that I have enjoyed reading. Nice blog. I will keep visiting this blog very often. 토토사이트

    ResponderEliminar
  17. 아주 좋은 주제, 비슷한 텍스트가 당신의 운동만큼 좋은지 모르겠습니다. 이것들은 가장 중요한 것을 보게 될 것이며, 응용 프로그램은 웹 사이트에 강력하고 중요한 인터넷 페이지를 제공합니다. 먹튀검증

    ResponderEliminar
  18. 시간을내어 토론 해 주셔서 감사합니다. 그 사랑을 강하게 느끼고이 주제에 대해 더 많이 읽었습니다. 지식을 얻는 것과 같이 가능하다면 추가 정보로 블로그를 업데이트 하시겠습니까? 나에게 매우 유용합니다 먹튀검증

    ResponderEliminar
  19. I appreciate you taking the time to talk about them with people. Buy Klonopin Online

    ResponderEliminar
  20. This kind of looks like it's surely exceptional. These kind of small facts are developed employing big selection involving requirements know-how. My spouse and i like the thought plenty. voyance par telephone

    ResponderEliminar
  21. Because of this , it truly is superior you can applicable research prior to providing. It will be possible to share larger document that way. top seo company in usa

    ResponderEliminar
  22. Hi would you mind letting me know which webhost you’re utilizing?

    I’ve loaded your blog in 3 different browsers and
    I must say this blog loads a lot quicker then most.
    Can you suggest a good internet hosting provider at a reasonable price?
    Many thanks, I appreciate it!

    Also visit my web page ::강남오피


    ResponderEliminar
  23. I have read your blog it is very helpful for me. I want to say thanks to you. I have bookmark your site for future updates 먹튀폴리스주소

    ResponderEliminar
  24. Way cool! Some extremely valid points! I appreciate you penning this post plus the rest of the website is also really good. 메이저놀이터

    ResponderEliminar
  25. This Post is providing valuable and unique information 메이저놀이터

    ResponderEliminar
  26. I read your post and I found it amazing! thank! 먹튀검증목록

    ResponderEliminar
  27. "Good post! We wilpl be linking to this great post on our
    site. Keep up the goodd writing." 먹튀폴리스꽁머니

    ResponderEliminar
  28. "Thank you for sharing your info. I really appreciate
    your efforts and I will be waiting for your further
    post thanks once again." 안전놀이터모음

    ResponderEliminar
  29. Glad to read. Do you want help with essay? Get it right from here without burning your pocket. Know more about essay help 토토사이트

    ResponderEliminar
  30. Just saying thanks will not just be sufficient, for the fantasti c lucidity in your writing. I will instantly grab your rss feed to stay informed of any updates. windshield replacement san diego

    ResponderEliminar
  31. Wonderful article. Fascinating to read. I love to read such an excellent article. Thanks! It has made my task more and extra easy. Keep rocking 먹튀검증

    ResponderEliminar
  32. "I was examining some of your articles on this internet site and I conceive this web site is really informative ! Retain posting .

    " 메이저놀이터

    ResponderEliminar
  33. In the world of www, there are countless blogs. But believe me, this blog has all the perfection that makes it unique in all. I will be back again and again 토토사이트

    ResponderEliminar
  34. Just saying thanks will not just be sufficient, for the fantasti c lucidity in your writing. I will instantly grab your rss feed to stay informed of any updates. polaris dealer

    ResponderEliminar
  35. I want to start a blog to write about everything that happens at school and
    with friends…anonymously…any sugestions?.부산오피

    ResponderEliminar
  36. I really like your writing style, great information, thankyou for posting 사설토토

    ResponderEliminar
  37. Excellent article..ts a good site to explore ..Thanks for the blog post.Really thank you! Much obliged. 검증사이트

    ResponderEliminar
  38. It’s not that I want to copy your web-site, but I really like the design. Could you tell me which design are you using? Or was it especially designed 사다리사이트

    ResponderEliminar
  39. It’s not that I want to copy your web-site, but I really like the design. 메이저놀이터

    ResponderEliminar
  40. at some point folks draw the line and say enough is enough when progress is not made. 안전놀이터

    ResponderEliminar
  41. I believe you have observed some very interesting details 바카라사이트

    ResponderEliminar
  42. Muy buena aportación, quiero agregar que la diferencia entre la pared de las Gram positivas y Gram negativas es debido al peptidoglicano que forma una pared más gruesa en las Gram positivas, contrario a las Gram negativas donde es una pared más delgada de lípidos (como se menciona en el blog).

    ResponderEliminar
  43. This blog is really great. The information here will surely be of some help to me. Thanks ! 에볼루션카지노

    ResponderEliminar
  44. you are so exciting! I don’t consider i’ve examine some thing like this before. So great to discover any other character with a few proper mind in this issue. Significantly.. Thanks for beginning this up. This website is some thing that is required at the net, a person with some originality! I quite like studying via a submit which can make males and females assume. Also, many thank you for allowing me to comment! Spot on with this write-up, i genuinely suppose this superb web site needs a remarkable deal more attention. I’ll likely be returning to peer more, thanks for the advice! I’m very thrilled to discover this page. I wanted to thanks on your time for this outstanding read!! I certainly truely favored every little bit of it and i also have you ever saved as a favourite to have a look at new matters to your internet site. 먹튀검증

    ResponderEliminar
  45. howdy awesome blog! Does jogging a blog which include this take a exquisite deal of labor? I've simply no information in programming however i was hoping to start my very own blog within the near destiny. In any case, ought to you've got any ideas or strategies for brand new weblog proprietors please percentage. I recognise this is off subject matter however i simply had to ask. Thank you i’m long past to deliver my little brother, that he need to additionally go to see this website on regular basis to take up to date from most modern information update. You certainly make it appear so clean along with your presentation however i locate this count number to be simply some thing which i suppose i might in no way apprehend. It seems too complicated and very huge for me. I’m searching forward in your subsequent publish, i’ll try to get the cling of it! 토토사이트

    ResponderEliminar
  46. i surely desired to compose a quick observation to explicit gratitude to you for all the notable guidelines you're setting in this website online. My instead long net investigation has now been paid with surprisingly correct insight to write about with my pals. I ‘d admit that most of us website visitors certainly are unequivocally blessed to exist in a beneficial internet site with so many top notch people with very useful ideas. I experience very glad to have stumble upon your weblog and sit up for so many more cool instances analyzing here. Thanks over again for loads of things. I must voice my passion on your type-heartedness for visitors who sincerely want assist to your query. Your unique commitment to passing the message up and down seems to be extraordinarily insightful and have in every case allowed buddies just like me to realise their hobbies. This useful hints indicates a good deal a person like me and mainly to my friends. With thank you; from anyone. 안전놀이터

    ResponderEliminar
  47. https://msatta1.wordpress.com/ exceptional data! I recently came across your weblog and were analyzing alongside. you made such an exciting piece to read, giving each subject enlightenment for us to benefit understanding. Thank you for sharing the such records with us to study this.. That is virtually interesting. It is exceptionally information and instead subjective. Thank you for taking the time to publish this information. I absolutely took satisfaction in analyzing this post, big follower. Keep up the first-rate and also please inform me while are you able to post much extra articles or where am i able to research greater on the subject? Thanks for posting this article regarding .

    ResponderEliminar
  48. best to be traveling your weblog once more, it's been months for me. Nicely this text that ive been waited for consequently lengthy. I need this newsletter to finish my assignment in the school, and has equal topic collectively with your article. Thank you, fine proportion. Actually unadulterated brilliance from you right here. I've in no way predicted something now not as an awful lot as this from you and have not confounded me by means of any reach out of the creative vitality. I renowned you will hold the fine work occurring. 카디즈에이전시

    ResponderEliminar
  49. hello, і study your blog occasіonally and that i own a comparable oone and i was just curious if you get a lot off spam feedback? If so һow do you protect agɑinst it, any plugin or something you could advise? I gеt so much latrly it’s dгiving me insane so any suρport is very much preferred. Absolutely preference to say your article is as brilliant. The readability to your post is simply excellent and that i'm able to suppose you’re knowledgeable in this situation. Quality collectively together with your permission permit me to comprehend your rss feed to hold up to date with forthcoming post. Thank you a million and please keep the profitable work. 먹튀대피소

    ResponderEliminar
  50. it’s first rate. This is one of the top websites with loads of useful data. This is an exceptional piece, and i respect this website; keep up the super paintings. Pretty informative blog on a way to carry an quit to the problems. I really like your creative blog and look forward to extra insightful posts. I truely playing each little little bit of it. It's far a wonderful website and first-class proportion. I need to thank you. True process! You men do a tremendous weblog, and feature some superb contents. Maintain up the good work. Superb message. I stumbled across your weblog and desired to mention that i clearly enjoyed reading your articles. Anyway, i'm able to enroll in your feed and desire you submit again soon 토토서치

    ResponderEliminar
  51. Your work is really valued round the clock as well as the world. It is a unbelievably comprehensive as well as helpful blog.
    Archives
    ePrimeFeed
    News
    Economy News
    Political News
    Technology News
    Sports News
    Movie News
    Fashion News

    ResponderEliminar
  52. GTA Online 토토사이트 Heist "The Big Con" 2-Players (Elite Challenge in Hard Mode)

    ResponderEliminar
  53. You are my inspiration , I possess few web logs and rarely run out from to post..magnificent submit, very informative. I wonder why the opposite experts of this sector do not realize this. You should continue your writing. I am confident, you ave a great readers a base already! 먹튀검증

    ResponderEliminar
  54. Excellent points?I would notice that as someone who in reality doesn’t write on blogs a lot (actually, this can be my first publish), I don’t assume th,,I found so many interesting stuff in your blog especially its discussion. From the tons of comments on your articles, I guess I am not the only one having all the enjoyment here! keep up the good work. 먹튀패스

    ResponderEliminar
  55. https://goostrey.info/qatar-email-lists/
    https://goostrey.info/romania-email-lists/
    https://goostrey.info/russia-email-lists/
    https://goostrey.info/saudi-arabia-email-lists/
    https://goostrey.info/slovakia-email-lists/
    https://goostrey.info/south-africa-email-lists/

    ResponderEliminar