Dentro del grupo de recuentos microbianos a
base de cultivos con formación de colonias, la técnica de vaciado en placa es
la más utilizada. La muestra en cantidades conocidas se coloca en cajas Petri estériles
y se adiciona el medio de cultivo fundido a una temperatura de 45ºC y se mezcla
con la muestra. Después de la incubación se cuentan las colonias desarrolladas,
las que multiplicadas por el inverso de la dilución que corresponda permite
estimar el número de microorganismos
viables por gramo o mililitro de muestra en las condiciones de prueba,
el recuento obtenido se referir a un determinado grupo de microorganismos.
La variedad se tipos y especies diferenciales
por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento,
oxigeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas constituyan
una estimación de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo
sanitario del producto ha sido adecuado. Para obtener resultados reproducibles
y por lo tanto significativos, es de suma importancia seguir fielmente y
controlar cuidadosamente las condiciones. La técnica consiste en contar las
colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de cierto tiempo y
temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un
microorganismo de la muestra bajo estudio.
Procedimiento:
1)
Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de
manera que la inoculación, la adición del medio de cultivo y homogenización, se
pueda realizar cómoda y libremente.
Marcar las cajas en sus tapas con los datos previamente a su
inoculación.
2)
Después de inocular las diluciones de las muestras
preparadas, en las cajas Petri agregar de 12 a 15 ml del medio preparado,
mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las
manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una
superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del
inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.
Dejar solidificar.
3)
Incluir una caja sin inoculo por cada lote de medio y
diluyente preparado como testigo de esterilidad.
4)
El tiempo transcurrido desde el momento en que finalmente
se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe excederse de 20 minutos.
5)
Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia
abajo) por el tiempo y la temperatura que se requiera, según el tipo de microorganismo
del que se trate.
Por
Ramírez Hernández Jessica
Técnicas
de vaciado en placa.
a)
Medios sólidos en placa.
1.
Cuando se
necesite preparar placas de medios de cultivo, efectuar el proceso de vaciado
en campana de flujo laminar o bien en la zona de trabajo bacteriológico del
mechero, siguiendo las siguientes recomendaciones:
2.
Una vez que el medio
sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente en un baño María a
una temperatura de 45± 2°C.
3.
Preparas las
placas en la mesa previamente etiquetadas y proceder a vaciar el medio.
1.
Dejar
entreabiertas las placas un momento para que el agua se evapore y no se
condense en la tapa, una vez desplazada el agua, tapar rápidamente.
El
medio sólido también es utilizado para realizar el recuento y aislamiento de
microorganismos para la técnica de extensión con varilla,. en esta técnica
contamos con el medio ya solidificado y adicionamos 0.1 ml del inoculo con la
superficie del medio, posteriormente esterilizamos la varilla y dejamos enfriar
para extender la muestra, como en las últimas 3 imágenes a continuación.
5.
En caso de existir burbujas en el medio hay que flamear con la flama del
mechero,
procurando agarrar el collarín para que no se apague, tapar la placa y dejar solidificar.
procurando agarrar el collarín para que no se apague, tapar la placa y dejar solidificar.
|
Cuando
el vaciar no queden burbujas, estas se pueden romper al hacer pasar la flama
del mechero sobre ellas (Nunca hacer este procedimiento cuando
se tenga ya el inoculo en la muestra).
|
6.
Los medios preparados se deben conservar de preferentemente en el
refrigerador y protegidos con bolsas de plástico.
7.-
Todos los medios de cultivo preparados deben llevar fecha de preparación.
8.-
De cada lote preparado de medio de cultivo, incubar dos placas a 35 ºC durante
48 horas como prueba de esterilidad.
b)
Medios en matraz para vaciado en placa.
1.
Cuando se
necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite,
colocarle un tapón de algodón con gasa y fundir el medio.
Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante.
2.
Una vez que el
medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un baño
María a una temperatura de 45 ± 2°C.
3.
Preparar las
placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar
el medio.
4.
Después de
inocular las diluciones de las muestras preparadas, agregar de 12 a 15 ml del
medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en
el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a
adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa
incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta
de las cajas y dejar solidificar.
c)
Medios en matraz para vaciado en placa de mohos levaduras.
1.
Cuando se
necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite,
colocarle un tapón de algodón con gasa y fundir el medio. Esterilizar el
medio a las condiciones que indica el fabricante.
2.
Una vez que el
medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un baño
María a una temperatura de 45 ± 2°C y adicionarle 1.4 ml de ácido tartárico al
10 % por 100 mL de medio.
3.
Preparar las
placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar
el medio.
d)
Medios líquidos en tubo.
1.
Preparar el
medio de cultivo (caldo) en un vaso de precipitados y colocarlo en un
dosificador regulado a 9 mL y proceder a colocarlo en tubos de ensaye de 16 X
150 mm con tapón de rosca, previamente etiquetados y conteniendo una campana de
Durham.
2.
Procurar no
cerrar los tubos de ensaye hasta el tope para evitar que estos exploten.
3.
Colocar los
tubos en un bote de lámina y colocarle papel Kraft a manera de gorro y proceder
a esterilizar a las condiciones que indica el fabricante.
4.
Una vez
esterilizados, dejar enfriar y colocarlos en un lugar fresco y seco o en el
refrigerador para evitar la evaporación.
5.
Cuando se
requiere tubos con otro tipo de caldo se le coloca a cada uno de los tubos 3
mililitros
Por Ramos Franco Michelle
Medios
en matraz para vaciado en placa.-
Cuando
se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se
necesite, colocarle un tapón de algodón con gasa y cubrir el medio.
1)
Esterilizar el
medio a las condiciones que indica el fabricante.
2)
Una vez que el
medio sale de la autoclave deje enfriar a temperatura ambiente o en un baño
maría a una temperatura de 45 grados – 2 grados centígrados
3)
Prepara las
plastas en la mesa previamente etiquetados y ya con el inoculo proceder a
vaciar el medio.
4)
Después de
inocular, las diluciones de las muestras preparadas, agregar de 12 a 15 ml de
medio preparado mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en
sentido de las manecillas de reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás hacia
adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa un
corporación de inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la cubierta de
las cajas y dejar solidificar.
NOTA:
medio de cultivo a temperaturas de 45 grados centígrados para realizar la
técnica de vaciado en placa.
Medios
en matraz para vaciado en placa de mohos, levaduras.-
Cuando
se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se
necesite, colocarle un tapón de algodón con gasa y fundir el medio.
1)
Esterilizar el
medio a las condiciones que indica el
fabricante.
2)
Una vez que el
medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperaturas ambiente o en baño
maría a una temperatura de 45 grados centígrados- 2 grados centígrados y
adicionarle 1.4 ml de acido tartárico al 10% por 100ml de medio.
3)
Prepara las
placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo preceder a vaciar
el medio
Por Rangel Osorio
Hugo
a.- Medios sólidos en placa
Cuando se necesite preparar placas de
medios de cultivo, efectuar el proceso de vaciado en campana de flujo laminar o
bien en la zona de trabajo bacteriológico del mechero, siguiendo las siguientes
recomendaciones.
1.- Una vez que el medio sale de la
autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un baño María a una
temperatura de 45 ± 2°C.
2.- Preparar las placas en la mesa
previamente etiquetadas y proceder a vaciar el medio 14
Medio sólido a 45 °C y vaciado en placa
del medio
3.- Dejar entreabiertas las placas un
momento para que el agua se evapore y no se condense en la tapa, una vez
desplazada el agua tapar rápidamente.
Diferentes placas con medio de cultivo
El medio sólido también es utilizado
para realizar el recuento y aislamiento de microorganismos por la técnica de
extensión con varilla, en esta técnica contamos con el medio ya solidificado y
adicionamos 0,1 ml del inoculo en la superficie del medio, posteriormente
esterilizamos la varilla y dejamos enfriar para extender la muestra.
Técnica de extensión con varilla
Medio sólido en placa, dejar
entreabierta la tapa de la caja de lo contrario se formará agua de
condensación, tal y como se muestra en la figura.
4.- En caso de existir burbujas en el
medio hay que flamear con la flama del mechero, procurando agarrar el collarín
para que no se apague, tapar la placa y dejar solidificar.
Cuando al vaciar nos queden burbujas,
estas se pueden romper al hacer pasar la flama del mechero sobre ellas (Nunca
hacer este procedimiento cuando ya se tenga el inoculo de la muestra)
5.- Los medios preparados se deben
conservar de preferentemente en el refrigerador y protegidos con bolsas de
plástico.
6.- Todos los medios de cultivo
preparados deben llevar fecha de preparación.
7.- De cada lote preparado de medio de
cultivo, incubar dos placas a 35 ºC durante 48 horas como prueba de
esterilidad.
b.- Medios en matraz para vaciado en
placa
Cuando se necesite preparar matraces con
medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle un tapón de algodón
con gasa y fundir el medio.
1.- Esterilizar el medio a las
condiciones que indica el fabricante.
2.- Una vez que el medio sale de la
autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un baño María a una
temperatura de 45 ± 2°C.
3.- Preparar las placas en la mesa
previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio.
4.- Después de inocular las diluciones
de las muestras preparadas, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado,
mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las
manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una
superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del
inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas y
dejar solidificar.
Técnica de vaciado en placa
Medios de cultivo a temperatura de 45°C
para realizar la técnica de vaciado en placa
c.- Medios en matraz para vaciado en
placa de mohos levaduras.
Cuando se necesite preparar matraces con
medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle un tapón de algodón
con gasa y fundir el medio.
1.- Esterilizar el medio a las
condiciones que indica el fabricante.
2.- Una vez que el medio sale de la
autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un baño María a una
temperatura de 45 ± 2°C y adicionarle 1.4 ml de ácido tartárico al 10 % por 100
mL de medio. 17
3.- Preparar las placas en la mesa
previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio
d.- Medios líquidos en tubo.
1.- Preparar el medio de cultivo (caldo)
en un vaso de precipitados y colocarlo en un dosificador regulado a 9 mL y
proceder a colocarlo en tubos de ensaye de 16 X 150 mm con tapón de rosca,
previamente etiquetados y conteniendo una campana de Durham.
2.- Procurar no cerrar los tubos de
ensaye hasta el tope para evitar que estos exploten.
3.- Colocar los tubos en un bote de
lámina y colocarle papel Kraft a manera de gorro y proceder a esterilizar a las
condiciones que indica el fabricante.
4.- Una vez esterilizados, dejar enfriar
y colocarlos en un lugar fresco y seco o en el refrigerador para evitar la
evaporación.
5.- Cuando se requiere tubos con otro
tipo de caldo se le coloca a cada uno de los tubos 3 mililitros
Por Rascón Castrejón Lizeth
Esta técnica puede aplicarse para la estimación
de microorganismos viables en una amplia variedad.
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, Él método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, Él método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
Procedimiento.
1. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera de inoculación. Marcar las cajas en sus tapas con los datos de inoculación.
1. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera de inoculación. Marcar las cajas en sus tapas con los datos de inoculación.
2. Agregar de 12 a 15 ml del medio preparado,
mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las
manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una
superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del
inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.
Dejar solidificar.
3. Incluir una caja sin inóculo por cada lote
de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.
4. El tiempo transcurrido desde en que la
muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de
cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
5. Incubar las cajas en posición invertida (la
tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el
tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
Cálculo
del método.
* Después de la incubación, contar las placas
que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias, usando el contador de
colonias y el registrador. Las placas de al menos una de tres diluciones deben
estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en el
intervalo apropiado. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha
dilución y reportar.
* Cuando dos diluciones están en el intervalo
apropiado, determinar la cuenta promedio dada por cada dilución antes de
promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por
gramo o mililitro.
* Placas con menos de 25 colonias.- Cuando las
placas corridas para el Cálculo del método menor dilución muestran cuentas de
menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes en dicha dilución,
promediar el número de colonias y multiplicar por el factor de dilución para
obtener el valor estimado de cuenta en placa. Aclarar en su informe esta
situación agregando la leyenda "valor estimado”.
* Después de contabilizar las colonias en las
placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de la dilución para obtener el
número de UFC por mililitro o gramo de la muestra. Redondear la cifra obtenida
en la cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos significativos al inicio
de esta cifra.
Informe de la prueba
Reportar como: Unidades formadoras de
colonias,___ UFC/g o ml, de bacterias aerobias en placa en agar triptona extracto
de levadura o agar para cuenta estándar, incubadas ________ horas a _______ ºC.
Por Reyes Marcial Luis Diego
I.
Medios en matraz para vaciado en placa.
Cuando se necesite
preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle
un tapón de algodón y fundir el medio.
1) Esterilizar
el medio a las condiciones que indica el fabricante.
2) Una
vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente.
3) Preparar
la placa en la mesa previamente etiquetada y ya con el inoculo proceder a vaciar
el medio.
4) Después
de inocular las diluciones de las muestras preparadas, agregar de 12 a 15 ml
del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6
en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en el sentido contrario y 6 de
atrás a adelante.
II.
Medios líquidos en el tubo.
1) Preparar
el medio de cultivo en un vaso de precipitado y colocarlo en un dosificador y
proceder a colocarlo en tubos de ensaye con tapón de rosca previamente
etiquetados.
2) Procurar
no cerrar los tubos de ensaye hasta el tope para evitar que estos exploten.
3) Colocar
los tubos en un bote de lámina y colocarle papel kraft a manera de gorro y
esterilizar.
4) Una
vez esterilizados, dejarlos enfriar y colocarlos en un lugar fresco y seco o en
el refrigerador para evitar la evaporación.
._.
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